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心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建

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中国组织工程研究与临床康复 第14卷 第50期 2010–12–10出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research December 10, 2010 Vol.14, No.50ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH9350Department of Cardiovascular Internal Medicine, Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, ChinaDing Jian-dong ☆, Doctor, Chief physician, Department of Cardiovascular Internal Medicine, Affiliated Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China dingjiandong@163. comSupported by: the Foundation forSociety Development of Nanjing, No. 200601055*Received: 2010-08-18 Accepted: 2010-10-24东南大学附属中大医院心血管内科，江苏省南京市210009丁建东☆，男，1965年生，博士，江苏省盐城市人，汉族，主任医师，主要从事先心病的介入治疗及发病机制的研究。

dingjiandong@ 中图分类号:R318 文献标识码:B文章编号:1673-8225 (2010)50-09350-04收稿日期：2010-08-18修回日期：2010-10-24 (20100518004/WJ ·Z)心脏转录因子GATA 结合蛋白4真核表达质粒的构建*☆丁建东，方 翔，陶绍玉，任利群，张晓黎，姚玉宇，马根山Construction of eukaryotic expression recombinant plasmid pCMV-Myc-GATA4Ding Jian-dong, Fang Xiang, Tao Shao-yu, Ren Li-qun, Zhang Xiao-li, Yao Yu-yu, Ma Gen-shanAbstractBACKGROUND: Studies showed that heart transcription factor GATA bind protein 4 (GATA4) are closely related to congenital heart disease. However, there are few reports about the construction of GATA4 expression plasmid and how it effects the development and proliferation of myocardial cell.OBJECTIVE: To construct the recombinant plasmid pCMV-Myc-GATA4.METHODS: Recombinant plasmid pUC57-GATA4 was digested by EcoR Ⅰand Kpn I to obtain the target gene GATA4. Double enzyme digestion was conducted for pCMV-Myc and GATA4. Both fragments were connected by using T4 ligase and transferred to DH5α. Then plasmid was extracted and detected by PCR and double enzyme digestion and sequencing.RESULTS AND CONCLUSION: The coding area of GATA4 for approximate 1.3 kb was obtained. The results of PCR, enzyme digestion and gene sequencing showed that the recombinant expression plasmid had correct codogenic gene fragment. The recombinant expression plasmid of GATA4 gene is successfully constructed and identified.Ding JD, Fang X, Tao SY, Ren LQ, Zhang XL, Yao YY, Ma GS. Construction of eukaryotic expression recombinant plasmid pCMV-Myc-GATA4.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(50): 9350-9353. [ ]摘要背景：有研究表明心脏转录因子GATA 结合蛋白4(GATA4)与先天性心脏病的发生有密切的关系，但其机制不明，而目前尚未查及GATA4真核表达质粒构建类的报道。

目的：构建人类心脏特殊转录因子GATA4的真核表达质粒。

方法：对重组质粒pUC57-GATA4进行酶切获得GATA4基因编码区序列，将真核表达载体pCMV-Myc 和GATA4基因在双酶切后用T 4连接酶连接，构建重组质粒pCMV-Myc-GATA4，转化至大肠杆菌，提取质粒后经聚合酶链反应、双酶切及测序鉴定。

结果与结论：实验成功酶切重组质粒获得GATA4基因编码区约1.3 kb 的目的片段，聚合酶链反应和酶切鉴定以及基因测序结果显示，构建的重组真核表达质粒中含有正确的GATA4基因序列，证实成功构建了含有GATA4基因的真核表达重组质粒。

关键词：转录因子；GATA4；重组质粒；真核表达载体；组织构建 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.50.010丁建东，方翔，陶绍玉，任利群，张晓黎，姚玉宇，马根山. 心脏转录因子GATA 结合蛋白4真核表达质粒的构建[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(50):9350-9353. [ ]0 引言心脏的发育过程是在多种转录因子的作用下进行转录调节的。

这些复合物包括了超过20种不同的转录因子，研究最多的有GATA 结合蛋白4 (GATA bind protein 4，GATA 4)、NK2相关转录因子5和T 盒转录因子5等转录因子 等[1]。

其中GATA4是影响心脏发育的关键性转录因子之一，也是胚胎发育过程中的早期标志之一。

在胚胎发育的7~7.5 d 的晚期原条阶段，其中胚层就可检测到GATA4 mRNA 的存在，随后在心内膜及心肌中表达，并且大量的GATA4 mRNA 继续在动物心肌中表达。

本课题组在前期研究中首次在中国散发性先天性心脏病患者中发现其GATA4基因外显子3的第52，58，61位分别插入一个碱基A ，等位基因的突变频率在先心病患者与正常人之间差异显著[2]。

为了深入探讨转录因子GATA4在先天性心脏病发病过程中可能的作用，实验应用酶切、PCR 电泳、核酸提取等技术构建含有GATA4的真核表达载体，并将此重组质粒转染入心肌细胞，观察细胞形态学和生物学行为可能的改变。

1 材料和方法设计：基因学实验。

时间及地点：实验于2009/2010-07在东南大学心血管病研究所完成。

材料：菌种：大肠杆菌DH5α菌种由东南大学心血管病研究所保存。

丁建东，等.心脏转录因子GATA结合蛋白4真核表达质粒的构建ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH9351 www.CRTER.org主要试剂及仪器：实验方法：将质粒pUC57-GATA4酶切获得目的基因GATA4：将克隆有目的基因GATA4的重组质粒pUC57-GATA4进行酶切验证，并进行序列测定，以检测其核苷酸序列与GATA4基因序列(Genebank NO. NC_000008.10)的编码区是否完全一致。

Eco RⅠ和KpnⅠ酶切位点已事先添加在目的基因GATA4上下游。

反应体系为重组质粒pUC57-GATA4 3 μL，10×Buffer M 1 μL，再加入重蒸水使总体积为9 μL，将管内溶液混匀后加入KnpⅠ和Eco RⅠ各0.5 μL，用手指轻弹管壁使溶液混匀。

酶切产物电泳及目的基因序列测定：将酶切的产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，在波长为254 nm的长波长紫外灯下观察。

DNA存在处可以见到桔红色荧光条带。

酶切的特异性条带用胶回收试剂盒进行回收，用于基因序列测定及下一步克隆。

目的基因送上海英骏生物公司测序。

目的基因GATA4亚克隆至pCMV-Myc载体及鉴定：回收产物经与pCMV-Myc载体进行连接，反应体系为pCMV-Myc载体1 μL，GATA4片段3 μL，10 × ligation Buffer 1.5 μL，T4 DNA ligase 1.5 μL，10 × BSA 1.5 μL，ddH2O 6.5 μL，总计15 μL，将混合体系在16 ℃连接过夜。

取1%大肠杆菌DH5α接种于含50 mL LB培养基的试管中，加入4 mL过夜培养物，于37℃振荡培养(250 r/min) 3 h至吸光度值(A600 nm)约为0.3，将培养液分装到50 mL预冷无菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~ 10 min。

然后于4 ℃，1 600 g，离心7 min，反复冻融制备感受态大肠杆菌。

将感受态细胞和4 ng质粒DNA混匀，冰浴30 min。

将Ep管置于42 ℃水浴中热击90 s，立即置于冰上三四分钟。

在Ep管中加LB培养基800 μL混匀，37 ℃培养1 h。

取0. 1 mL，接种LB平板(AMP 100 mg/L)，37 ℃培养过夜，挑选几个较大的周围没有杂菌的白色菌落，接种于液体LB培养基(AMP 100 mg/L)，37 ℃，160 r/min振荡过夜。

超纯质粒DNA纯化试剂盒提取质粒：取1.5 mL培养物入微量离心管中，用微量离心机于4 ℃以最大转速离心30 s，将细菌沉淀重悬于100 μL预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

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DNA与蛋白质相互作用的结构特征

DNA与蛋白质相互作用的结构特征

DNA 与蛋白质相互作用的结构特征Sectio n 7 Structural Characteristics of In teractio n betwee n DNA and Protein反式作用因子必须与顺式作用元件相结合，才能发挥其调节基因表达的作用。

反式作用因子至少含有三个功能域，即 DNA 结合功能域，转录活性功能域和其它转录因子结合功能域。

反式作用因子的 DNA 结合功能域具有一些带共性的结构特征，如同源结构域、碱性亮氨酸 拉链模体、锌指模体等。

1. 螺旋-转角-螺旋模体（Helix-Turn-Helix （ HTH ）Motif ） 1.1 原核生物 HTH 模体（Prokaryotic HTH Motif ） 色氨酸阻遏因子和分解产物基因激活蛋白（CAP ）均为同二聚体，分子结构中含HTH 模体,该模体由两段a -螺旋和一段 &转角构成（但需要另外伸出的第三个 a -螺旋才能稳定），第二 个a -螺旋负责识别 DNA 大沟序列，故称为识别螺旋（图 103）。

图103 HTH 模体的分子结构Fig 103 Molecular Structure of HTH Motif1.2 真核生物 HTH 模体（Eukaryotic HTH Motif ） 1.2.1同源异型结构域（Homeodomain ）同源异型结构域的氨基酸残基序列与原核细胞类似，由三段 a -螺旋，环绕一个疏水核心折叠而成。

所不同的是识别螺旋较长，在 DNA 大沟中的定向有所不同，其典型的结合位点是TATA 盒（图 104）。

图104同源异型结构域的分子结构Fig 104 Molecular Structure of Homeodoma in 1.2.2 MYB HTH 模体（MYB HTH Motif ）为HTH 模体的变体，其结构类似于同源结构域，但其3转角由5个残基构成，识别螺旋与 434 represssor/DNA (helix-turn-hellx)DNA有较长的接触面（图105）。

真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的构建及其在体内外细胞中的表

真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的构建及其在体内外细胞中的表

中国实验诊断学 ２１ 年 １ 第 １ 卷 箜 塑 ０１ 月 ５ 文 章 编 号 ：０７ ２７ ２ １） １ ０ １ ０ １０ —４ ８（０ １０ —０ １ — ４
பைடு நூலகம்
真 核 表 达 质 粒 Ｐ Ｄ Ａ ．（ 一 有 白蛋 白信 号 肽 ｅ Ｎ ３ １ ＋）带 的 Ｖ ｓｓ ｔ （２ —８ ａ） ａｏｔ ｉ １０１０ ａ 的构 及 其 在 体 内外 ａｎ 建
用该质粒治疗全身新生血管类病 奠定了一定基础 ． 关键词 ： ａｏｔ ｎ １０１０ａ ；９Ｔ细胞 ； Ｖ ｓ ｆ （２－８ａ ）２３ ｓ ａ ｉ 基因克隆 ； 真核 表达
中 图分 类 号 ：７２ Ｑ ８ 文 献 标 识 码 ： Ａ
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真核载体构建

真核载体构建


42℃、90sec
不含抗生素的培养基热休克 得到细菌的克隆
37℃ 涂布选择性平板 30-60min （合适抗生素） （使质粒扩增）
37℃ 10hr
2.感染（infection）：也称转导（transduction） 由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程 有一个：体外包装过程
lDNA ®E-coli 动、植物病毒DNA ®动植物细胞
PCR扩增
vDNA polymerase 高保真酶 primerstar probest Phusion vRich GC sequence primerstar with GC buffer v热启动PCR，Nest PCR
载体构建步骤
v Get the target DNA sequence v Select appropriate vector v PCR primer design v Obtain cell or tissue v PCR amplification v Restriction, ligation and transformation
克隆载体→表达载体
A A
双 酶 切
表达载体
限制性内切酶
连接
v PCR product:vector 1：10~ 10:1（1：3 ~ 3：1）摩尔比 v At 25 °C for 2­3 hours or at 16 °C overnight v Inactive T4 DNA ligase (at 70 °C for 10min )
2. 缺点：①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 ②基因产物纯化工艺复杂 ③基因产物易受污染（内毒素） ④基因产物对受体菌有毒害作用 ⑤基因产物易被水解 ⑥从安全角度——并不理想 ⑦缺乏基因产物表达后加工机制
质粒构建

质粒构建

3.3.4 α-MHC-Pop1-hGH转基因载体的构建根据体外结果的提示，我们试图构建Pop1在体内的过表达系统，于是，我们接下来想研制Pop1在心脏中特异性过表达的转基因小鼠。

α-MHC是心肌细胞特异性表达的标志分子，利用其心脏特异性启动子元件能实现Pop1心脏中特异性表达。

我们设计构建了Pop1转基因载体如图3-4A所示，其具体过程为：以小鼠基因组DNA 为模板扩增获得小鼠Pop1，引物为：Pop1-CDS-S：5’ GTCGACCCAGACAAGTCCCAGAAA 3'Pop1-CDS-A：5’ GAATTCACACCTTCCGTCTTGGTA 3’PCR 扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保温。

目的片段，克隆入T 载体中，测序结果确认序列准确无误后亚克隆至转基因的骨架载体。

通过多种酶切显示，Pop1转基因载体的酶切图形与预期相符。

说明Pop1转基因载体构建成功（图3-4B）图3-4、α-MHC-Pop1-hGH转基因载体结构示意图及酶切鉴定图A.α-MHC-Pop1-hGH转基因载体结构示意图;B.转基因载体酶切鉴定图.第二部分: 拟通过心脏特异性GEFT敲除小鼠模型研究在病理性心肌肥大的过程当中，GEFT基因在组织学、功能学以及细胞生物学方面的作用。

申请人对野生型小鼠以及GEFT心脏特异性敲除小鼠，进行病理刺激以诱发其心肌肥厚，然后利用超声心动图检测GEFT对心肌肥厚造成的。

等功能学指标的变化有无影响，然后取心脏组织进行石蜡包埋切片，利用HE染色、Masson三色、免疫组化以及电镜等方式，探索GEFT敲除对心肌肥厚过程当中，在组织形态、纤维沉积、细胞尺寸、细胞内在结构的变化中的作用。

同时分离野生型和敲除型新生小鼠原代心肌细胞，以及分离大鼠原代心肌细胞并通过腺病毒介导GEFT过表达，然后通过肥大刺激诱导心肌细胞肥大生长，评价GEFT对于心肌肥厚的影响是否为心肌细胞自主性的。