实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
（一）实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
（二）实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 （三）实验器材
1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）
2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油
简单染色
微生物染色原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
使用草酸铵结晶紫染色液，染色迅速，着色深，菌体呈紫色。
步骤
1、涂片
1. 取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水；
2. 用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔；
3. 将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
2、干燥
将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥。也可用电吹风低温吹干。
3、固定
手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次。
原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4、染色
将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。
染色时间：吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min；草酸铵结晶紫染色约1min。
5、水洗
将细菌涂片上染液倒入废液缸中；手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。
注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。
6、干燥
自然干燥：平放于室温，自然干燥；
吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干；
吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。
细菌的简单染色
实验二 细菌的简单染色
一、目的要求
1. 学习微生物涂片、染色的基本技术。
2. 初步认识细菌的形态特征。
3. 掌握细菌的简单染色法。
二、基本原理
染色是细菌学上的一个重要而基本的操作技术。因细菌个体很小，含水量较高，在油浸镜下观察细胞几乎与背景无反差，所以在观察细菌形态和结构时，都采用染色法，其目的是使细菌细胞吸附染料而带有颜色，易于观察。
细菌的简单染色法，是用一种染料处理菌体，此方法简单，易于掌握，适用于细菌的一般观察。
常用碱性染料进行简单染色。这是因为:在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此，碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
三、材料及器材
菌种:培养24h的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，培养12,16h的枯草杆菌，牙垢。
四、方法与步骤
1. 涂片
用接种环以无菌操作从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许菌体，与水滴混合均匀，涂成极薄的菌膜。
2. 干燥
涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略微加热，使之迅速干燥。
3. 固定
固定的目的是:杀死微生物，固定其细胞结构;保证菌体能牢固地附着在载玻片上，以免水洗时被水冲掉;改变菌体对染料的通透性，一般死细胞的原生质容易着色。
4. 染色。滴加结晶紫或其它染色液，覆盖玻片涂菌部分，染色1min。 5. 水洗。
6. 干燥。
7. 镜检。
五、实验报告及作业
1. 绘出枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、螺旋菌的形态图，注明放大倍数。
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
一、目的与要求
1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点
3、识别细菌革兰氏染色结果
二、实验原理：
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。
三、实验器材
1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；
2、仪器 显微镜；
3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；
细菌的简单染色步骤：
细菌的革兰氏染色步骤：涂 片,干 燥,固 定,结晶紫染 色,水 洗,碘液媒染,水 洗,乙醇脱色,水 洗,番红复染,水 洗,干 燥,镜 检.
五、实验关键步骤和注意点：
