关于冰冻切片的若干问题

冷冻切片方法及注意事项一、实验前准备清理实验台及仪器。

开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。

准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。

二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。

（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。

甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。

）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。

2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。

4、调好防卷板。

制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。

切片时，以切出完整、平滑的切片为准。

切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。

注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。

常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。

B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。

（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。

）②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。

冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。

它是术中诊断的一种重要方法。

但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。

归结起来有以下几方面。

1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。

切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。

导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。

1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。

1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。

1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。

1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。

1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。

冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。

!组织大小要适中。

冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。

一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。

另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。

#掌握好冷冻时间。

根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。

冰冻切片的局限性：
1、冰冻切片因急于快速诊断，取材局限，致使取材不足，有时可能误诊、漏诊；有时局部小标本不能代表整个标本，或根本没有取到病变组织。

因此，有时某些病例冰冻切片组织与手术切除的大标本的石蜡切片组织像差异比较大，造成冰冻切片的诊断与石蜡切片的诊断不一致。

2、对于某些疑难病例、交界性病变，有时难以确诊，如勉强诊断则易误诊，故应该等待常规石蜡诊断结果，以决定是否行二次手术。

3、冰冻切片质量多不如常规石蜡切片，且常有人工假像，导致诊断困难，则有时造成假阴性或假阳性病例出现，故此冰冻切片诊断的准确性一般为95％左右，有时误诊是难以避免的，临床决定手术方案时，一定要综合考虑后实施。

4、部分组织不宜做冰冻切片，如骨、脂肪、钙化组织、脑组织、淋巴组织及部分软组织肿瘤等，该切片主要针对乳腺、甲状腺、子宫及双附件、食管、胃肠及部分肺肝肾部位肿瘤做出病理诊断，故此有其局限性，不是所有组织都行冰冻诊断，因此，冰冻切片诊断一定要与病理科预约，征询病理医生能否行冰冻切片诊断。

5、在实际工作中，手术中病理诊断也确实对临床手术方案的制定起到了重要的指导作用，但是必须说明的是，因为诸多因素的局限，手术中病理诊断并不是最后的病理诊断，冰冻切片与手术后石蜡切片的诊断有可能不相符合，最终以石蜡切片病理诊断为最后诊断。

手术中冰冻切片检查规范一、手术中冰冻切片检查注意事项(一) 手术中冰冻切片检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题，尤其需要临床医师与病理医师间的密切合作。

(二) 手术中冰冻切片检查要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片的观察，向手术医师提供参考性病理诊断意见，由于组织未得到充分有效的固定、脱水以及切片较厚等等，与石蜡切片病理诊断的准确率有一定的差距，一般仅限于良、恶性的鉴别。

与常规石蜡切片的病理诊断相比，手术中冰冻切片检查具有更多的局限性和误诊的可能性，误诊率5%以上。

有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。

(三) 有关临床医师应于手术前向患者和／或患者授权人说明手术中冰冻切片检查的意义和局限性等，取得患者和／或患方的知情和理解。

患者和／或患者授权人应在由医院制定的《手术中冰冻切片检查知情同意书》签署意见和签名。

(四) 主持手术的临床医师应在手术前一天向病理科递交手术中冰冻切片检查申请单，填写患者的病史，重要的影象学、实验室检查结果和提请病理医师特别关注的问题等。

一般不接受电话预约和临时申请手术中冰冻切片检查。

（五） 手术中冰冻切片检查的手术标本在切除后应立即送到病理科，并注明手术的部位，重点部位应做标记或加以说明。

同时手术标本应保持新鲜，不要加用固定液或用含水溶液清洗，以免影响制片和诊断。

（六） 手术中冰冻切片检查诊断报告一般在手术标本送达病理科后30分钟内做出。

并以书面文字形式通知临床手术科室。

特殊情况（如标本过大，取材过多，或多个冰冻标本同时送检等），报告时间可以超过30分钟。

（七） 工作开展时间：手术中冰冻切片检查的开展时间为周一至周五，周六和周日如有需要可提前预约。

（八） 手术医师应在手术后及时填写常规石蜡病理检查申请单到病理科，以便病理科及时发出常规病理报告。

二、手术中冰冻切片检查适用范围(一) 需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。

冰冻切片注意事项冰冻切片是一种常用的实验技术，在科学研究、医学诊断和药物开发中起着关键作用。

这种技术可以将组织样本以无损坏的方式保存，并用于后续的显微镜观察和分析。

然而，要获得高质量的冰冻切片需要注意一些重要的事项。

以下是一些关键的注意事项。

1.选择合适的切片仪器和材料：要获得最佳的切片效果，应选择高质量的切片仪器和材料。

切片仪器应具备高速度和高精度的切割能力，并且能够保持适宜的温度和湿度。

切片材料应选择具有较好的冷冻保护性能和切割性能的材料。

2.适当的标本处理：在进行冰冻切片前，标本应进行适当的处理。

首先，标本应被固定以保持其形态和结构的稳定性。

常用的固定方法包括冷冻固定、化学固定和生理盐水固定等。

其次，在进行冷冻切片前，标本应进行充分的去水处理，以使切片的质量更好。

3.适宜的切片温度：切片温度是决定切片质量的重要因素。

一般情况下，切片温度应尽量低，以减小标本的结构变形和切割的损伤。

通常，切片温度应控制在-20℃至-30℃之间。

4.适当的切片速度：切片速度是决定切片厚度和切片质量的关键因素。

切片速度过快会导致切片厚度不均匀，切片速度过慢则容易引起标本的变形和损伤。

一般情况下，切片速度应适中，并且应根据不同的标本类型进行调整。

5.切片后的处理：切片后，切片应立即进行处理，以防止切片的结构变形和氧化。

处理方法包括立即放入冷冻保存或石蜡包埋等。

6.切片的储存和保存：冰冻切片在使用前需要进行储存和保存。

一般情况下，切片应保存在低温环境中，以保持其形态和结构的稳定性。

冷冻切片的保存时间一般较短，通常为几天至几周。

7.切片质量的评估：为了确保冰冻切片的质量，应对切片进行适当的评估。

评估的方法包括显微镜观察和组织学染色等。

通过评估，可以发现切片中存在的问题，并采取相应的措施进行改进。

总之，冰冻切片技术在科学研究和医学诊断中具有重要的应用价值。

遵循上述的注意事项，可以获得高质量的冰冻切片，从而提高实验和诊断的准确性和可靠性。

冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种在生物组织学研究中广泛应用的技术，它可以制备出细胞和组织的高质量切片，用于后续的染色、免疫组化和显微镜观察等研究。

为了获得高质量的冰冻切片，制作过程中需要严格控制各个环节，包括样本取材、固定、冻结和切片等步骤。

同时，质量控制也是制作高质量冰冻切片的重要环节之一、下面将详细介绍冰冻切片制作及质量控制的相关内容。

1.样本取材样本取材是制作高质量冰冻切片的第一步，样本的选择和处理对后续切片的质量有重要影响。

通常情况下，应选择代表性的组织，样本必须新鲜，不宜暴露在空气中过长时间，以避免氧化和细胞坏死的发生。

此外，为了使切片更容易涂抹和切割，样本应具有一定的硬度，可以根据需要使用组织固定剂、切片缓冲液等进行处理。

2.组织固定组织固定是为了保持组织的形态结构和细胞的生物学特性，同时防止样本在切片过程中的损伤和变形。

常用的固定方法包括冷醇固定、中性缓冲福尔马林固定等。

固定时间和温度的选择需要根据不同的样本和研究要求进行优化。

3.冻结冻结是制作冰冻切片的关键步骤，它能够快速、有效地固定组织并保持组织的形态。

冻结样本时应使用冷冻剂，如液氮、干冰-酒精混合物等。

在冻结过程中，要避免组织在冻结过程中受到机械或化学损伤，因此可以使用特制的冷冻模具和刀片。

4.切片5.质量控制质量控制是确保冰冻切片质量的关键环节之一、常用的质量控制指标有切片厚度、切片完整性、目标细胞或结构的保存等。

切片厚度的一致性对于后续的显微镜观察和数据分析具有重要影响，可以使用显微镜或数字软件测量切片厚度。

切片完整性是指组织切片的连续性和无碎片断裂等情况，可以通过显微镜观察和染色评估。

目标细胞或结构的保存是评价冰冻切片质量的重要指标，可以通过免疫组化染色、细胞核染色等方法进行评估。

综上所述，制作高质量的冰冻切片需要控制好样本取材、组织固定、冻结和切片等环节，并通过质量控制手段来评估切片质量。

只有在每个环节都进行精细操作和严格控制的情况下，才能制备出适合后续研究的高质量冰冻切片。

冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。

固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。

固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。

固定液分为单纯固定液和混合固定液。

单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。

本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。

固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。

对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。

【注意事项】1.固定要及时。

2.组织块的大小要合适。

3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。

4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。

5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。

6.选择合适的固定液。

7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。

二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。

脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。

本实验所用的是乙醇脱水。

乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。

缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。

为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。

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问：【1】本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。

因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。

祝好运吧！2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小不等的圆形洞洞,不知道是什么原因.答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题:30%的蔗糖脱水过夜----一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够的.从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔.2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT包埋、液氮冷冻。

只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。

3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好.4、液氮速冻可以防止组织冰晶的形成冰冻切片心得1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作.4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤)5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.如果是全脑的话，放在30%蔗糖（PBS或PB配）中沉底会很慢，我们都用双蒸水配，先20%沉底，再30%沉底，想要沉底快可将脑先切成小块。