发酵工程复习资料资料

发酵工程复习资料

发酵工程：利用微生物的生长和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程理论与工程技术体系。 该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与分离 纯化制备等技术集成。

发酵的本质

1、显微镜观察：微生物 2、著名的巴斯德实验：微生物作用3、著名的毕希纳实验: 酵素（酶）的作用

本质：由微生物的生命活动所生产的酶的生物催化作用所致。

发酵动力学：是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生产的动态平衡及其内在规律。

二. 发酵工业菌种

一、工业上常用的微生物

1. 细菌

醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌、乳酸杆菌、枯草杆菌、丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌、 谷氨酸棒状杆菌

常用的细菌：

大肠杆菌

应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸 乳酸杆菌

应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作 枯草芽抱杆菌

应用：生产淀粉酶

2. 酵母菌

种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母

应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪

3. 霉菌

黑曲霉：应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶 黄曲霉：应用：酱油、酱类（淀粉酶）

米曲霉：应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲

土曲霉：应用：生产甲义丁二酸

毛霉：应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作

根霉：种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉

应用：酿酒

青霉：应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶

红曲霉：应用：用于南方红曲酒（女儿红）的生产；用于红色色素的生产、豆腐乳的生产等

4. 放线菌：种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌 应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素

5. 未培养微生物

定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微 生物群落中占有非常高的比例，约为 99%。

研究方法 1 •模拟自然培养法：原位培养、培养条件优化、

单细胞操作

2. 宏基因组分析法

二、发酵工业菌种分离筛选

菌种选择的总趋势

野生菌-变异菌

自然选育一代谢控制育种

诱发基因突变—基因重组的定向育种

1. 分离的思路

新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方 法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。

实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。

有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。

设计筛选方案时必须考虑两个要点：1.选择性2.灵敏度

2. 新种分离与筛选的步骤

样品的采集一一 ＞样品的处理一一 ＞目的菌富集培养一一 ＞分离纯化一一 ＞性能测定

1. 样品的米集原则：

(1) 样品的来源越广泛，获得新种的可能性越大，特别是在一些苛刻的环境如：高温、高压、 高盐等极端环境中。

(2) 了解目标产物的性质和可能目标产物的微生物种类及其生理特征：

☆微生物在代谢上具有一定的规律，次生代谢在进化上后移，芽抱菌以上才有筛选意义。

☆分离不同种类的微生物时，还要考虑微生物的生理特性。如：要筛选纤维素酶产生菌，要到富 含纤维素的土壤中采样，如深林土壤。

采样的注意事项

1、 采样时应尽可能保持相对无菌；

2、 所采集的样本必须具有某种代表性；

3、 采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；

4、 应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；

5、 采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于 4C下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦 采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生 物群体之间就会出现消长

2. 样品的处理

(1) 物理方法： 热处理、膜过滤、离心法

(2) 化学方法：通过在培养基中加入某些化学成分来增加特定微生物的数量。

(3) 诱饵法：将一些固体物质，如：石蜡、花粉、蛇皮、毛发等，加到待分离的土壤或水中做 成诱饵，将期菌落长成后再进行平板分离，可获得某些特殊的微生物种类

3. 富集培养

定义：就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，以促使目标 菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。

方法：

（1） 控制培养基的营养成分 （2） 控制培养条件

（3） 添加抑制剂

添加专一性抑制剂也可达到抑制不需增殖的微生物的目的 •如土样悬浮液中加数滴 10%

酚可抑制霉菌和细菌的生长，而放线菌仍生长；又如添加青霉素，链霉素之类抗生素能抑制细菌的 生长.

4. 分离纯化

尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的 方法有划线分离法、稀释分离法。

5. 生产性能的测定

一、 菌种分离的一般过程：

土样的采取一土样预处理一 富集培养一 菌种初筛-----菌种复筛----性能鉴定--菌种保藏 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物。

二、 目的微生物富集的一些基本方法

富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

复筛

复筛是在初筛的基础上进一步鉴定菌株的生产能力的筛选，采用摇瓶培养，一般一个菌株重 复3— 5瓶（较优的菌株）培养后的发酵液米用精确的分析方法测定。

实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目） 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 采样（造纸厂）—80度30分钟处理

以1%CMC羧甲基纤维素）为唯一碳源、pH10.5的平板上，培养3〜4天，然后再平板上加入1% 刚果红染色，Nacl脱色后选择有透明圈的菌落

从285个土样中获得62株:26株为组成型，36株为诱导型

实验题（或许会有用）：淀粉酶可以通过微生物发酵生产，为了提高酶的产最，请你设计一个实

验，利用诱变育种方法，获得产生淀粉酶较多的菌株。①写出主要实验步骤。②根据诱发突变率

低和诱发突变不定向性的特点预期实验结果。（提示：生产菌株在含有淀粉的固体培养基上，随 其生长可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈。）

1. 主要实验步骤：①将养好的生产菌株分两组。一组用一定剂量的诱变剂处理，另一组不处理做 对照。②制备含淀粉的固体培养基。③把诱变组的大量菌株接种于多个含淀粉的固体培养基上， 同时接种对照组，相同条件下培养。④比较两组菌株菌落周围透明圈的大小，选出透明圈变大的 菌株。预期实验结果：①由于诱发突变率低，诱变组中绝大多数菌落周围的透明圈大小与对照组 相同。②由于诱发突变不定向性，诱变组中极少数菌落周围的透明圈与对照组相比变大或变小

2. 氨基酸产生菌的筛选 u.v 线杀死长好的菌落 对应到copy前相应位置，找到目的菌 落 4目的菌落进行液体培养, 对产物进行定量测定—— 筛选产物含量高的菌株 样品 预处理

初筛（除真菌）

在分离平板上生长获得多个单菌落

复印平板（copy法）坷 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸

铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂

J培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈

发酵工业菌株的鉴定：

通常把鉴定微生物技术分为四个不同的水平：

（1） 细胞的形态和习性水平：例如用经典的的研究方法，观察细胞的形态特征、运动性、酶反 应、营养要求和生长条件

（2） 细胞组分水平：包括细胞组成成分如：细胞壁成分、细胞氨基酸库、脂类、醌类以及光合 作用色素等的分析，所用的技术除常规的实验室技术外，还使用红外光谱、气相色谱和质谱分析 等技术。

（3） 蛋白质水平：包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等技术

（4） 基因或核酸水平：包括核酸分子杂交（DNA与 DNA、DNA与RNA、（ G+C含量的测定、遗 传信息的转化和转导、16SrRNA或 18SrRNA寡核苷酸组分分析、以及DNA或 RNA的核苷酸序列分 析等。

三. 发酵工业培养基设计

培养基：指用于维持微生物细胞生长繁殖和产物形成的营养物质。

二、发酵工业培养基的营养成分及来源

（一）碳源：

1、 作用

（1、提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳骨架

（2）提供合成目的产物所的原料

2. 常用的碳源：

（1） 糖类：葡萄糖、淀粉、糖蜜

（2） 油和脂肪：豆油、菜子油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等

（3） 有机酸：乳酸、柠檬酸、乙酸

（4） 烃和醇类：正烷烃、乙醇

（5） 生物质：木材、秸秆、草类等

3. 发酵培 的选择原则：

* （1）必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。

* （2）有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。

* （3）有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。

* （4）有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。

* （5）尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。

* （6）原料价格低廉，质量稳定，取材容易。

* 7）所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。

（8）有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。 淀粉水解糖的制备

第一步：利用淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加； （液化）

第二步：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖。 （糖化）

* 3.酸酶结合法：

4. 淀粉水解糖的制备方法（目的使淀粉变成葡萄糖）：酸解法；酶解法；酸酶结合水解法。

5. 糖蜜可分为：甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。糖蜜前处理的方法：加酸通风沉淀法；加热加酸沉淀法添 加絮凝剂澄清处理法；

（1） 酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡萄糖。

用酸酶法水解淀粉制糖，酸液化速度快，且糖化是由酶来进行的，对液化要求不高，可采用 较高的淀粉乳浓度，以提高生产效率。

（2） 酶酸法：将淀粉先用淀粉酶液化到一定程度，然后用酸水解成葡萄糖。

糖蜜预处理的方法

（1） 加酸通风沉淀法

（2） 加热加酸沉淀法

（3） 添加絮凝剂澄清处理法

絮凝剂：聚丙烯酰胺

（二） 氮源

1、 无机氮源

种类：氨盐、硝酸盐和氨水

所以选择合适的无机氮源有两层 作用：

（1）满足菌体生长 （2）稳定和调节发酵过程中的pH

2、 有机氮源

来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、 玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。

（三） 生长调节物质

生长调节物质：发酵培养基中某些成分的加入有助于调节产物的形成，这些添加的物质称为生长 调节物质。包括生长因子、前提、产物抑制剂和促进剂。

1、 生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等 均称生长因子。

2、 前体：前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接在微生物生物合成过程中合成到产物 分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高的一 类化合物。（采用少量多次的流加工艺）如：苯乙酸、甘氨酸、吲哚、氨茴酸等

（二）培养基的类型

（1） 斜面培养基