菌种的管理和保藏

菌种保藏

（一）、菌种保藏的目的

微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

（二）、菌种保藏的原理

无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

（三）、菌种保藏的方法

1、斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。

该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。

2、石蜡油封藏法

此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。

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菌种保藏管理制度

1 目的 建立菌种保藏管理制度，明确菌种保藏的条件，确保菌种质量。

2 适用范围 适用于苗种保藏管理。

3 责任者 QC负责人、菌种管理人员。

4 管理内容

4．1 菌种应由专人保藏管理，保证检验、科研交换和使用，并确保安全。

4．2 建立菌种登记台帐制度，记录所保藏菌种的名称、来源、编号、标准菌号、购进数量、剩余数量及保藏方法。

4．3 对购进的标准菌种，开启分离后进行菌种保藏，以及其他须保藏的菌种应填写菌种保藏登记卡，记录菌种名称、编号、标准菌号、来源及购进时间。菌种用液体石蜡法保藏1年（特殊菌种除外），工作用菌种用琼脂斜面低温保藏法。

4．4 工作用菌种每2～3月传代一次，6个月分离一次，传代、分离时间应记录。每年对用液体石蜡保藏的菌种检查存活情况，种株纯度及有关特性，记入登记卡。保留3年菌种传代、、分离、保藏记录（一般菌种传代不超过10代）。

4．5 废弃的菌种须经消毒灭菌处理（121℃30min）方可洗涤，严防污染。

4．6 各菌种保藏选择最适培养基，并严格按配方配制，不得任意更改。

4．7 外单位在我公司购买工作用菌种，须出示单位证明，并保证卖出菌种存根。

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程

传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.3.2.2液体石蜡保存法

对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.4菌种的传代

传代用菌种每年进行一次复苏和传代。复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。

5.5菌种的使用 使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。

5.6菌种的销毁

菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。

菌复苏、复壮；

Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；

青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。

5.4.1.1.3复苏步骤：

1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；

2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；

3.用接种针在相应的培养基上进行接种；

4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。

5.4.1.2标准菌株的确认

通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。

5.4.1.3标准菌株的传代

将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。传代次数不宜过多，一般不超过10代。

保藏菌种的方法

保藏菌种的方法有以下几种：

1. 冷冻保存：将菌株培养至富集期，制备稀释液，加入保护剂，将菌株在-70℃以下的冰箱中保存，可保存1年以上。

2. 真空冷冻干燥：将菌株培养至富集期，制备稀释液，加入保护剂，将菌株在-50℃下真空冷冻干燥，干燥后保存于防潮、密封的瓶中，可保存3-5年。

3. 石蜡包埋法：将菌株培养至富集期，制备溶剂，用石蜡包埋法制备成固体菌株片，可在常温下保存2-3年。

4. 液氮保存：将菌株培养至富集期，制备稀释液，加入保护剂，将菌株放入液氮罐中保存，可保存数十年。

以上方法均需在菌株保存前进行无菌检测，避免交叉污染。同时，在保存过程中，要注意防止温度变化、光照、湿度等因素的影响。