WESTERNBLOT常用液体配方

Western Blotting 所用溶液

1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 500 ml

Tris-base 90.85 g

ddH2O 400 ml

用浓盐酸调pH 至8.8

定容至500 ml，高压灭菌，室温保存。

1 M Tris-HCl (pH 6.8) 500 ml

Tris-base 60.57 g

ddH2O 400 ml

用浓盐酸调pH 至6.8

定容至500 ml，高压灭菌，室温保存。

10%(w/v) AP (过硫酸铵) 20 ml

AP 2g

ddH2O 20 ml

分装到 1.5ml离心管，1ml/tube，-20°C保存

10%(w/v) SDS (十二烷基硫酸钠) 100 ml

SDS 10g

ddH2O 90 ml

用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水定容至100ml，室温保存。

10x Running Buffer (电泳缓冲液) 500 ml

1X Running Buffer?: 0.025M Tris, 0.25M Glycine, 0.1% SDS

10X Running Buffer?: 0.25M Tris, 2.5M Glycine, 1% SDS

配方：Tris 15.1 g

甘氨酸 93.75 g

SDS 5.0 g

ddH2O 400ml，搅拌直至完全溶解后，定容至500ml，室温保存。

电泳时10x Running Buffer取100ml，加ddH2O 900ml，定容至1L，配成1X Running Buffer.

1X Running Buffer可反复使用4-5次。

10x Transfer Buffer (转膜缓冲液) 500 ml

1X Transfer Buffer: 0.025M Tris, 0.192M Glycine, 0.037% SDS，20% Methanol

10X Transfer Buffer: 0.25M Tris, 1.92M Glycine, 0.37% SDS

Western blotting溶液配置: 1.裂解液的配置(可以直接买

50mmol/L Tris-CL PH=8.0

150mmol/L Nacl

0.1% SDS

100μg/ml PMSF(可以直接买

1% NP-40

1%Triton X-100

2.10*TBST 1L的配置:(需要

1MTris-base 50ml

5M Nacl 30ml

Tween-20 1ml

去离子水800ML 调节PH至7.6 定容至1000ML 3.转膜缓冲液1L 的配置:(需要

甘氨酸14.4g

Tris-base 3.03g

甲醇200ml 加去离子水定容至1L

4. 10%脱脂奶粉溶液(安怡

5. 分离胶(10ml

水 3.3ml

30%Arc+Bis 4ml

分离胶缓冲液 2.5ml

10%SDS 0.1ml

10%AP 0.1ml

TEMED 0.008ml

6.浓缩胶(5ml

水 3.4ml

30%Arc+Bis 0.83ml

浓缩胶缓冲液0.63ml

10%SDS 0.05ml

10%AP 0.05ml

TEMED 0.01ml

7.电泳缓冲液(10*

终浓度1倍10倍

Tris base 2.5mM 15.1g 60.4g

Glycine 192mM 72.1g 288.4g

SDS 0.1% 5.0g 20g

去离子水到5L 到2L

8. 30%Arc+Bis溶液

(29gArc +1gBis/100ml 一般配500ml,过滤,用锡纸避光,4度保存9. 分离胶缓冲液:

Tris-HCL PH=8.8 1.5mol/L

Tris-base: 1.5*121/1000ml=18.15g/100ml 调PH值到8.8,定容到100ml

10.浓缩胶缓冲液

Tris-HCL PH=6.8 1mol/L

Tris-base 1*121/1000ml=12.1/100ml 调PH到6.8,定容到100ml 11.10%SDS

Westernblot试剂配制及操作流程

试剂配制：

1.电泳缓冲液：

a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1

b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.1

2.蛋白提取缓冲液：

a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g

NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4

b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。

操作流程：

1.样品制备：

a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。

b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。

2.SDS-凝胶制备： a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine

(TEMED)，混合均匀。

b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。

c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。

3.蛋白电泳：

a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。

b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。

c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。

d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。

4.免疫印迹：

a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。

全蛋白提取组织裂解液配方

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------------------------------------------日期xxxx 【精品文档】

【精品文档】 Western-Blot 全蛋白提取组织裂解液配方

1. 储备液

1.1 10% Triton X-100

Triton X-100 10ml

蒸馏水 90ml

混合后37℃-40℃水浴中2-3hr，使其充分混匀

1.2 10% 去氧胆酸纳

去氧胆酸纳 1g

蒸馏水 10ml

避光保存

1.3 200mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氯)

异丙醇 5ml

分装，-20℃保存

1.4 100mmol/L EDTA

蒸馏水 10ml

1.5 1mg/mL亮抑酶肽(Leupeptin)

亮抑酶肽 2mg

蒸馏水 2ml

分装，-20℃保存

1.6 1mg/mL 抑蛋白酶肽(Aprotinin)

抑蛋白酶肽 2mg 【精品文档】

【精品文档】 蒸馏水 2ml

分装，-20℃保存

1.7 1mg/mL 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)

胃蛋白酶抑制剂 2mg

甲醇 2ml

分装，-20℃保存

2. 工作液

2.1 Tris-base (50mmol/L，pH 7.4)：

Tris-base 605mg

NaCl 900mg

蒸馏水 75ml

2.2 10% Triton X-100 10mL

2.3

2.4 100mmol/L EDTA 1mL

2.5 用前加入：

1mg/mL亮抑酶肽 100l

1mg/mL 抑蛋白酶肽 100l

1mg/mL 胃蛋白酶抑制剂 100l

200mmol/L PMSF 500l