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GmXTH23基因的克隆及抗旱性鉴定

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2020，42（5）DOI：10.13836/j.jjau.2020101ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensishttp://xuebao.jxau.edu.cn江西农业大学学报

GmXTH23基因的克隆及抗旱性鉴定

陈龙，张沿政，李永光*，李文滨

（东北农业大学农学院/大豆生物学教育部重点实验室/农业部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，黑龙江哈尔滨150030）

摘要：【目的】木葡聚糖内转糖苷酶（XTH）与细胞壁的生理活动及抗逆性密切相关。课题组前期对干旱胁迫下大豆转录组的结果进行分析，发现大豆Glyma.13G095000（GmXTH23）基因是一个编码木葡聚糖内转糖苷酶（XTH）的基因，基于GmXTH23基因表达量受干旱胁迫影响显著的事实，通过生物信息学、表达模式分析及抗性鉴定试验等研究，为进一步探究GmXTH23基因的功能提供依据，为大豆抗逆的遗传改良提供理论参考。【方法】以垦丰16大豆为试验材料克隆GmXTH23基因；利用qRT-PCR方法探究基因的表达模式；利用基因枪法进行亚细胞定位；将GmXTH23基因转入拟南芥中，并进行干旱胁迫下的表型试验；用茚三酮比色法测定游离脯氨酸含量，氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶含量，硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛含量。【结果】GmXTH23在大豆各组织中皆有表达，在茎中的表达量最高；亚细胞定位的结果表明该基因蛋白定位于细胞膜上；干旱胁迫下的表型试验结果表明，过表达GmXTH23基因的拟南芥植株发芽率、根长皆高于野生型拟南芥，复水后恢复正常的植株比例也相对较高；过表达株系与野生型株系相比其PRO含量与SOD含量较高，MDA含量较低。【结论】与野生型拟南芥相比，过表达GmXTH23基因使得拟南芥在干旱胁迫下的耐受性增强。在干旱胁迫下GmXTH23通过提高脯氨酸与超氧化物歧化酶含量、降低植物细胞在胁迫下的损伤来提高植物的抗旱性。

关键词：大豆；GmXTH23；木葡聚糖内转糖苷酶；基因克隆；胁迫响应中图分类号：S565.1文献标志码：A文章编号：1000-2286（2020）05-0898-08

CloningofGmXTH23GeneandIdentification

ofItsDroughtResistance

CHENLong，ZHANGYan-zheng，LIYong-guang*，LIWen-bin

（KeyLaboratoryofSoybeanBiology，CollegeofAgronomyNortheastAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofSoybeanBiologyandGenetics，MinistryofAgriculture，Harbin，Heilongjiang150030，China）

Abstract：［Objective］XTHiscloselyrelatedtothephysiologicalactivityandstressresistanceofcellwall.Theresultsofsoybeantranscriptomeunderdroughtstresswereanalyzed，anditwasfoundthatsoyGlyma.13

g095000（GmXTH23）geneisawoodenglucandantianglycosidase（XTH）gene，basedonthefactthatGmXTH23geneexpressionquantityissignificantlyaffectedbydroughtstressresearchesthroughbioinformatics，expres⁃sionpatternanalysisandtestsofresistanceidentificationwerecarriedout，tolayasoundfoundationforfurtherexploringthefunctionofGmXTH23gene，andprovidetheoreticalbasisforgeneticimprovementofsoybeanres⁃

收稿日期：2020⁃04⁃05修回日期：2020⁃06⁃14基金项目：国家重点研发计划项目（2016YFD0100304）和国家大豆基因工程核心项目（2016ZX08004002）ProjectsupportedbytheNationalKeyR&DProject（2016YFD0100304）andtheNationalCoreSoybeanGeneticEngineeringProject（2016ZX08004002）

作者简介：陈龙，orcid.org/0000-0001-7067-1561，*****************；*通信作者：李永光，副研究员，博士，主要从事大豆遗传育种研究，orcid.org/0000-0002-9171-2729，********************.cn

。陈龙，张沿政，李永光，等.GmXTH23基因的克隆及抗旱性鉴定［J］.江西农业大学学报，2020，42（5）：898-905.第5期陈龙等:GmXTH23基因的克隆及抗旱性鉴定

isfance.［Method］GmXTH23genewasclonedfromKan-Feng16soybean.qRT-PCRwasusedtoexploreitsex⁃

pressionpatterns.Subcellularlocalizationwascarriedoutbygenegunshot.GmXTH23genewastransferredinto

Arabidopsisthalianaandphenotypictestswereperformedunderdroughtstress.Thecontentsoffreeproline，su⁃peroxidedismutase（SOD）andmalondialdehyde（MDA）weredeterminedbythecolorimetricmethodsofninhy⁃

drin，n-bluetetrazoleandthiobarbituricacid.［Result］GmXTH23wasexpressedinallsoybeantissuesandthe

highestexpressionwasfoundinstem.Theresultsofsubcellularlocalizationshowedthatthegeneproteinwaslo⁃

calizedonthecellmembrane.Phenotypictestsunderdroughtstressshowedthatthegerminationrateandroot

lengthofoverexpressedarabidopsisth23werehigherthanthoseofwildarabidopsisth23，andtheproportionof

plantsreturningtonormalafterrehydrationwasalsorelativelyhigh.ThecontentsofPROandSODandMDAin

theoverexpressedstrainwerehigherthanthoseinthewildstrain.［Conclusion］Comparedwithwild-typeArabi⁃

dopsis，theoverexpressionofGmXTH23geneenhancedthetoleranceofArabidopsisunderdroughtstress.Underdroughtstress，GmXTH23increasedthecontentsofprolineandsuperoxidedismutaseandreducedthedamage

ofplantcells.

Keywords：soybean；GmXTH23；xyloglucanendogenousglycosidase；genecloning；stressresponse

【研究意义】据相关研究[1]，我国耕地面积中干旱与半旱地区约占45%。干旱灾害极大地限制了作物产

量，使粮食严重减产。大豆的产量与品质受干旱影响严重，因此，发掘优质的抗旱基因，是提高大豆抗旱性

的有效途径。【前人研究进展】木葡聚糖水解酶/内转糖苷酶（XTH）是重构细胞壁的重要物质，其机制是通

过催化作用，使木葡聚糖分子断裂重连，对植物的纤维素-木葡聚糖结构进行修饰从而影响细胞壁结构[2]。

按照序列特征，XTHs被划分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类[3-4]，其中III类被划分为IIIA和IIIB两个小类[5]。IIIB类、I类和II类的XTHs能内切木葡聚糖分子，产生还原性的末端，再和另一个木葡聚糖链相连接，其木葡聚糖内转糖

苷酶（XET）活性非常显著[5-7]。IIIA类则显示出木葡聚糖水解酶（XEH）活性，专一水解木葡聚糖的β-1，4糖

苷键。XTH酶的特征序列是DEIDFEFLG，此序列中包含了能够介导催化活性的氨基酸残基。该催化位点

附近的苏氨酸或丝氨酸残基由N-糖基化修饰[7-8]，与酶活性有重大关联。N-糖基化位点保守在IIIA亚类中

未被发现[5]，但在XTHs蛋白I/II类中已经被发现。XTHs蛋白的C-末端可以形成能够稳定蛋白质结构的二

硫键，因为其通常含有高度保守的半胱氨酸。前人的研究成果[9]表明XTH与植物组织的的生长发育相关，

如在拟南芥中AtXTH31参与了根的生长伸长；BcXTH1的过表达促进了花枝的生长从而使得株高增加[10]；AtXTH15、19、16、17能够通过调节细胞壁延展性来促进叶柄伸长[11]；在梨果成熟软化过程中PC-XET1可能

参与了细胞壁的降解[12]。近期有研究[13-15]表明XTH还受环境胁迫影响，如在重力作用下拟南芥中AtXTH22

表达量明显上升；在缺氧条件下，矮慈姑中的一些XTH基因表达上调[16];在拟南芥中xth15突变体与野生型

相比，植株的耐铝性提高[17]；过表达CaXTH3能够增强转基因拟南芥的抗旱性和耐盐性[18]。

【本研究切入点】通过本课题组前期研究发现，大豆基因GmXTH23在干旱胁迫下表达量显著增加，

但是在植物抗旱生理中行使的功能尚未明确。【拟解决的关键问题】本试验通过同源克隆的方法从垦丰16中得到基因GmXTH23；利用qRT-PCR技术对基因在大豆不同组织内和模拟干旱胁迫下的表达情况进

行分析；通过检验目的基因与黄色荧光蛋白同源重组质粒的蛋白质产物进行基因亚细胞水平定位；利用

蘸花法侵染拟南芥得到过表达株系，同时对过表达株系进行干旱胁迫，观察表型并测量相关生理指标，

验证GmXTH23基因在植物抗旱生理中的作用，探究其作用机制，为进一步研究GmXTH23基因功能提供

理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料1.1.1植物材料本研究所用大豆材料垦丰16，拟南芥材料是由实验室自行繁殖并保存的哥伦比亚野

生型（Columbia-0）。··899

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苦瓜MAP30基因克隆与鉴定

苦瓜MAP30基因克隆与鉴定

２０１３年１月第１　１卷第２期　苦瓜ＭＡＰ３０基因克隆与鉴定　郝林　姜波　韩从辉　庞慧　（１徐州市中心医院泌尿外科，江苏徐州２２１００９；　・实验研究・　５７　何厚光　付昱　张俊杰　张培影　２徐州市中心医院中心实验室，江苏徐州２２１００９）　【摘要】目的克隆苦瓜Ｉ型核糖体失活蛋白ＭＡＰ３０全长基因并构建其表达载体。方法提取苦瓜的基因组ＤＮＡ，根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已公开　发表的ＭＡＰ３０序列，设计出一对特异性引物。采用ＰＣＲ技术，从苦瓜的基因组ＤＮＡ中获得ＭＡＰ３０全长序列共８６０ｂｐ，克隆入ｐＥＴ－２８ａ（＋）　载体中，进行酶切及测序鉴定。结果克隆了ＭＡＰ３０全长基因，经测序证实与Ｇｅｎｂａｎｋ中收录的ＳＥＡ基因序列同源性迭１００％。结论本　研究成功地克隆了ＭＡＰ３０全长基因，为进一步研究ＭＡＰ３０基因的靶向抗肿瘤研究奠定了基础。　【关键词】苦瓜ｉ型核糖体失活蛋白；载体构建；序列分析　中图分类号：Ｒ３９４　文献标识码：Ｂ　文章编号：１６７１—８１９４（２０１３）０２－００５７－０２　苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ　ｃｈａｒａｎｔｉａ，ＭＣ）为葫芦科苦瓜属植物，是一种　药食同源的植物，其根、茎、叶、花、果实、种子皆可人药。具有清　热解毒、降低血糖、抗突变、抗ＨＩＶ、抗肿瘤、抗生育、抗菌、免疫　调节等作用。苦瓜的活性成分种类繁多，包括苦瓜Ｉ型核糖体失活蛋　白（ＭＡＰ３０）、三萜类、生物碱类、甾类化合物、糖类、有机酸类及　微量元素等。ＭＡＰ３０是苦瓜中相对分子质量为３００００的抗获得性免疫　缺陷综合征病毒的蛋白质，它属于单链Ｉ型核糖体失活蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＩＰ）家族Ⅲ，此类蛋白普遍存在于高等植物中，因　可使真核细胞核糖体失活而得名，它具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多　种生物活性。由于ＭＡＰ３０抗肿瘤活性强、毒性低，已成为近年抗癌药　物研究的热点。本研究克隆苦瓜Ｉ型核糖体失活蛋白（ＭＡＰ３０）全长　基因，为进一步研究ＭＡＰ３０基因片段在抗肿瘤中的作用提供了实验基　础。　１材料与方法　１．１材料　幼嫩苦瓜１个，大肠埃希菌ＤＨ５ａ和质粒ｐＥＴ－２８ａ（＋）为Ｓａｎｇｏｎ公　司产品。Ｔ４ＤＮＡ连接酶，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，限制性内切酶ＢａｍＨ　Ｉ、　Ｘｈｏ　Ｉ均购自Ｔａｋａｒａ公司，质粒小量提取试剂盒购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，其　余试剂均为分析纯。　１．２苦瓜ＭＡＰ３０基因的扩增　①引物设计：根据ＮＣＢＩ上的序列设计扩增引物：Ｆｏｒｗａｒｄ：　５’．ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＴＴＡＣＴＡＣ．３’ｌ　Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’．ＣＣ　ＧｃＴＣＧＡＧＡＴＴＣＡｃＡＡＣＡＧＡＴＴＣｃ－３’，其中红色部分分别为限制性　内切酶ＢａｍＨ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ酶切位点序列。②模板制备：刮取幼嫩苦瓜瓜　皮，于液氮中研磨，按照植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒进行苦瓜基因组　提取。￣ＰＣＲ扩增ＭＡＰ３０全长基因。④ＰＣＲ产物回收：用１％琼脂糖凝　胶电泳对ＰＣＲ产物进行分离，并用Ａｘｙｇｅｎ公司的琼脂糖凝胶ＤＮＡＮ收　试剂盒回收目的基因片段。　以上述所得基因组为模板，以ｐＦ和ｐＲ为引物，扩增ＭＡＰ３０全长基　因，反应体系如表１。　反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性３０ｓｅｅ，６０Ｃ退火３０ｓｅｃ，　７２＇（２延伸２ｒａｉｎ，共３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。　１＿３将目的基因连接到载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）　基金项目：中医药管理局项目资助（ＬＺ１　１　１　３４）；徐州Ｉ市科技计划　项目（ＸＺＺＤ１　０５０）　・通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｐｙｉｎｇ５８＠１　２．６．ｃｏｍ　表１　ＰＣＲ扩增ＭＡＰ３０基因的反应体系　成分　体积　模板　上游引物（１０　Ｍ）　下游引物Ｐ（１０“Ｍ）　２　Ｘ　Ｔａｑ酶ＰＣＲ反应混合物　２１１ｄｄＨ：Ｏ至总体积　１　Ｌ　１　Ｕ　Ｌ　１“Ｌ　２５　ｕ　Ｌ　５０　Ｌ　将ＭＡＰ３０目的基因的ＰＣＲ产物与ｐＥＴ－２８ａ（＋）载体酶切产物进　行连接，１６＂（２反应过夜。转化ＤＨ５ａ感受态细胞，涂氨苄抗性平板，　３７＂Ｃ过夜培养，筛选克隆，反应体系如表２。　表２　ＰＣＲ）￣物ｐＥＴ－２８ａ（＋）的连接反应　成分　体积　ｐＥＴ－２８ａ（＋）载体　ＭＡＰ３０基因　２×Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　￣１］ｄｄＨ２Ｏ至总体积　８　Ｈ　Ｌ　１“Ｌ　２　Ｌ　２０　Ｌ　１．４重组质粒的酶切鉴定和序列测定　对重组质粒进行酶切鉴定，反应体系如表３。　表３　ｐＥＴ－２８ａ（＋）一ＭＡＰ３０酶切反应体系　成分　体积　１０×缓冲液　重组质￣．ＤＮＡ　ＢａｍＨＩ　Ｘｈｏ１Ｉ　｝ｇｌｄｄＨ２Ｏ至总体积　２　ｕＬ　１Ｏ　ｕＬ　０．５　ｕＬ　０．５　ｕＬ　２０¨Ｌ　３７℃作用２ｈ后１％琼脂糖凝胶电泳分析，各选择酶切鉴定正确的　两个克隆送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。　２结果　苦瓜ＭＡＰ３０基因的克隆：根据ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋ上公布的ＭＡＰ３０全　基因序列，在ＭＡＰ３０基因阅读框起始与末尾设计引物，ＰＣＲ扩增目的　基因。目的基因片断长度约为８６０ｂｐ，与理论值相符。　３讨论　Ｉ型核糖体失活蛋白（ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＩＰ）是一种强　碱性单链蛋白质，主要富集在苦瓜种子、根、茎及叶中，具有抗肿瘤　和抗病毒等生物学活性。此类蛋白的主要功能是Ｎ—ＲＮＡ糖苷酶活性及　切断ＤＮＡ超螺旋活性，故核糖体失活蛋白可能具有类ＳＯＤ活性。研究　表明，ＭＡＰ３０对许多肿瘤细胞有较强的抑制作用。Ｐａｒｋ￣ｔＴｌ发现ＭＡＰ３０　对许多类型病毒感染的细胞、肿瘤细胞非常有效，而对未感染的人正　常细胞，包括Ｔ２细胞、巨噬细胞、单核细胞以及非肿瘤患者的血、肾　脏、肝脏、神经、精子细胞、皮肤细胞和胚胎细胞等均无毒性。

甘薯IbCAF1基因的克隆及耐盐性、抗旱性鉴定

甘薯IbCAF1基因的克隆及耐盐性、抗旱性鉴定

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2020, 46(12): 18621869 /

ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@

本研究由国家自然科学基金项目(31872878), 国家重点研发计划项目(2018YFD1000700, 2018YFD1000704)和国家现代农业产业技术

体系建设专项(CARS-10)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31872878), the National Key Research and Development

Program of China (2018YFD1000700, 2018YFD1000704), and the China Agriculture Research System (CARS-10). * 通信作者(Corresponding author): 翟红, E-mail: zhaihong@

第一作者联系方式: E-mail: 757015572@

Received (收稿日期): 2020-02-27; Accepted (接受日期): 2020-06-02; Published online (网络出版日期): 2020-07-02.

URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20200702.1029.002.html DOI: 10.3724/SP.J.1006.2020.04045

甘薯IbCAF1基因的克隆及耐盐性、抗旱性鉴定

陈杉彬 孙思凡 聂 楠 杜 冰 何绍贞 刘庆昌 翟 红*

小麦抗旱相关基因的克隆与表达分析

小麦抗旱相关基因的克隆与表达分析

小麦抗旱相关基因的克隆与表达分析

随着气候变化的加剧，旱灾已经成为全球面临的重大问题之一。干旱对农作物的影响尤为显著，因为大多数农作物对水的需求很高。作为世界上最重要的粮食作物之一，小麦的种植面积广泛，但它也面临干旱的威胁。因此，探讨小麦抗旱相关基因的克隆和表达分析对于提高小麦的耐旱能力具有重要的意义。

一、小麦抗旱基因的克隆

小麦是一种具有复杂基因组的植物，其基因组大小达到16Gb以上。因此，小麦抗旱基因的克隆是一个具有挑战性和复杂性的任务。目前，通过转录组学和基因组学等高通量技术，在小麦中成功克隆了许多抗旱相关基因。

例如，一个名为TaLEA（Triticum aestivum late embryogenesis abundant）的基因，是小麦中的一个耐旱相关基因家族。研究表明，TaLEAs能够在小麦的叶片和根中被高水平表达，并且与小麦的耐旱性密切相关。此外，研究还发现，通过对TaLEAs做突变体分析，可以发现该基因家族在小麦耐旱机制中的重要作用。

二、小麦抗旱基因的表达分析

小麦是一种具有遗传多样性的植物，对于不同环境的应对能力也有所不同。因此，对小麦中抗旱基因的表达分析有助于了解其耐旱能力的形成和机制。

以一个名叫TaNAC2的转录因子为例，发现它与小麦干旱逆境中叶片的抗氧化相关基因表达显著相关。此外，该基因家族在不同品种的小麦中表达存在差异，表明TaNAC2可能是小麦干旱耐性差异的潜在生物标记物和基因工程改良小麦抗旱性的优良靶点。

三、小麦耐旱性相关基因与其他生物的研究比较

小麦的耐旱性机制是一个复杂的生理和分子调控网络。近年来，研究人员通过比较小麦与其他植物和微生物的基因组和转录组数据，发现了一些关键的抗旱基因。例如，一个名为Xero2的转录因子，在小麦的叶片中表达显著，并且该基因也在鼠尾草和水稻中表达。这证明了小麦与其它耐旱植物中存在一些相同的抗旱机制。类似地，许多与小麦耐旱性相关的微生物基因组研究也揭示了一些小麦耐旱基因的潜在候选者。

水稻抗旱基因克隆与功能分析

水稻抗旱基因克隆与功能分析

水稻抗旱基因克隆与功能分析

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是全球人口最多的食物来源之一。然而，气候变化和人类活动对水稻生长环境的影响使得旱灾成为水稻生产的一个主要问题。为了解决这个问题，诸多科学家和研究者们致力于水稻抗旱相关基因的克隆和功能分析。本文将就此主题进行深入探讨。

一、水稻抗旱基因的克隆

基因克隆是研究生物学领域中最为基础的工作之一。对于水稻抗旱相关基因，研究者们主要采用了几种方法进行克隆：

1. 定向克隆方法

定向克隆方法利用已知的水稻基因序列，设计引物并通过PCR扩增得到目的基因。这种方法通常需要先进行序列分析，以确定检测到的基因是否确实与抗旱有关。

2. 突变法

突变法是一种重要的工具，在基因识别中也有着广泛的应用。通过一种方法制造突变体，通常是突变基因的一部分进行替换，然后筛选出表现与正常个体不同的后代，以此来确定与抗旱相关的部分。这种方法已经被证明是相当有效的，已经被成功的应用于水稻抗旱基因的克隆中。 3. 比较基因组学

比较基因组学是另一种克隆方法。这种方法通过比较已知基因组里的两个或多个不同物种的基因组序列，以发现相同或相关的DNA序列。这些DNA序列被认为可能控制抗旱程度，因此是在水稻远缘物种中寻找抗旱基因的最重要的方法之一。

二、水稻抗旱基因的功能分析

水稻抗旱基因的克隆帮助了我们确定了哪些区域与抗旱有关。接下来的任务是进行功能分析，以进一步了解基因如何工作，从而指导作物育种。

1. 基因转录与表达分析

在确定与抗旱相关的基因后，下一步是通过转录分析研究其表达模式。实验方法可以采用RT-qPCR和Northern blots等。

2. 基因诱导逆境试验

基因诱导逆境试验是一种通过农艺手段给水稻植株施加不同的逆境处理来模拟自然环境的方法。通过人为加压或人造干旱的处理，可以更好的研究与抗旱相关的基因的作用。

3. 基因敲除技术 基因敲除技术是通过人为干扰特定基因的表达，来分析某一基因在水稻生长时是否影响其抗旱性的技术。该技术通常通过RNAi或TALEN技术实现。