过氧化物酶活性的测定实验报告

1 过氧化物酶（POD）活性测定

一、原理：

过氧化物酶含铁，广泛存在于植物组织中，可催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，当有H2O2 存在时，过氧化物酶可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其在470nm处有最大吸收峰，故可用分光光度计在470nm处测定其吸光值，即可求出该酶的活性。

二、实验准备：

仪器：分光光度计、离心机、秒表、研钵、磁力搅拌器、移液管、电子天平、冰箱、100ml容量瓶、试管、胶头滴管、试管架、烧杯、吸水纸、比色皿、剪子

试剂：

0.05 mol/L愈创木酚；2%H2O2； pH 6.0的磷酸缓冲液；75%酒精；蒸馏水

试剂配制:

○1pH 6.0的磷酸缓冲液:0.2mol/l NaH2PO4 (27.6g NaH2PO4•H2O 用蒸馏水配成1000ml）取87.7ml和0.2mol/l Na2HPO4 （71.7g Na2HPO4•12H2O 或53.65g Na2HPO4•7H2O 用蒸馏水配成1000ml）取12.3ml后混合，用蒸馏水稀释至200ml即可。

○22%H2O2：取6.7ml 30%H2O2于烧杯中，再加入93.3mL蒸馏水（或加蒸馏水稀释至100mL），搅拌均匀。

○30.05 mol/L愈创木酚：准确称取6.2g愈创木酚，再用95%的乙醇配制定容至100ml即可。

三、步骤：

○1粗酶液的提取：称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(pH 6.0的磷酸缓冲液)，研磨，再加入9 mL提取液，将匀浆全部转入离心管中，于4 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清液即为酶的粗提取液，收集上清液于冷处（冰箱4℃保存）。

○2酶活性的测定：将4 mL反应混合液( pH 6.0的磷酸缓冲液2 mL,酶液1 mL,0.05 mol/L愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H202加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm波长下用U 2800型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每15 s记录1次，记录 2 2 min，另外以缓冲液代替酶液作为较零对照组。

实验四 植物组织中过氧化物酶活性的测定

一、 实验目的：

1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。

二、实验原理：

过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化H2O2氧化，以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。在有H2O2存在的条件下，过氧化物酶使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。

三、实验仪器及材料：

1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表

2、材料与试剂： 苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKH2PO4

四、实验步骤：

1、POD的提取

分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。

2、POD活性的测定

取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KH2PO4作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。

取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。

五、实验结果：

1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。

2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：

30s 60s 90s 120s 150s 180s

苹果POD

0.249 0.259 0.267 0.271 0.277 0.280

绿豆幼苗

POD 1.56 1.662 1.731 1.804 1.875 1.940

苹果酶液OD值与时间的关系曲线图 反

应

时 样

品

OD 0.220.230.240.250.260.270.280.290.330s60s90s120s150s180s210s240s系列1

I

毕 业 设 计（ 论 文 ）

题目 干旱胁迫下小麦过氧化物酶活性的变化

作者

学院 生命科学学院

专业 生物科学

学号

指导教师

二〇一三年六月五日

II 干旱胁迫下小麦过氧化物酶活性的变化

摘 要

以豫麦69种子为材料，利用沙基培养法培养小麦幼苗，用Hoagland培养液浇灌。在小麦幼苗培养到第10天时，对其中一半的小麦幼苗进行干旱处理。在干旱处理后的第3天、6天、9天进行过氧化物酶活性的测定，采用比色法，用分光光度计在470nm波长下测量其吸光值，以每分钟OD值变化表示其酶活性大小。实验结果表明：在干旱胁迫下，小麦幼苗过氧化物酶活性提高，随干旱时间延长，过氧化物酶活性增长速率减慢。

关键词：小麦；干旱；过氧化物酶

Abstract

We take Yumai 69 as the material,culture the wheat seedlings with Chaki,and

irrigate them with Hoagland culture medium.Half of zhe wheat seedings were divided

under drought.To determine the peroxidase’s activity in the drought treatment after the

third day, the sixth day and the ninth day, and use the guaiacol colorimetric,

Spectrophotometer at 470nm wavelength to measure the resultant content, take the

OD changes in the value per minute as the enzyme activity size. The results showed

班级：植物092 姓名：徐炜佳 学号：03

淀粉酶活性的测定

一、研究背景及目的

酶是高效催化有机体新陈代谢各步反应的活性蛋白，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物体内扮演着极其重要的角色，因此对酶的研究有着非常重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到

淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种，存在于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。

α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标,α-淀粉酶活性低的品种抗穗发芽,反之则易穗发芽。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种,活力单位的定义也各不相同,国内外测定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝胶扩散法、3 ,5-二硝基水杨酸比色法和降落值法 。这3 种方法所用的材料分别是新鲜种子、萌动种子和面粉,获得的α-淀粉酶活性应该分别是延迟(内源)α-淀粉酶、萌动种子α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。

测定方法 优点 缺点

DNS 灵敏、准确、精确度高,适宜精确测量小样品α-淀粉酶活性大小 测定步骤较繁,不便分析大量样品,测定范围较窄

凝胶扩散法 简便、快速、省时、省力,消耗材料和药品较少,不需要特殊仪器,测定范围较宽 边界不清晰,灵敏度与准确度较低,不适宜精确测量α-淀粉酶活性的大小

降落值法 快速、省时、重现性好、平行性好、消耗的药品少,适宜于测量大量样品 消耗的材料多,间接测定α-淀粉酶活性大小

本实验的目的在于掌握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和测定方法。

二、实验原理

萌发的种子中存在两种淀粉酶，分别是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在下则发生钝化。本实验的设计利用β-淀粉酶不耐热的特性，在高温下（70℃）下处理使得β-淀粉酶钝化而测定α-淀粉酶的酶活性。