感受态细胞的制备步骤和原理

一、目的

1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。

2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。

二、原理

（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理

所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子

的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。

目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说：

1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有：

（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；

（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；

（3）适量的溶菌酶能提高转化率。

2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶 位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；

（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；

（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。

目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：

近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。

大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明

带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。

带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。

具体步骤

1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。

2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10

min，以回收细胞。

4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80

mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。

6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10

min，以回收细胞。

7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。

8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。

9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。

农杆菌电击感受态的制备及电击转化

表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化

（1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒

pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。

（2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。

（3）农杆菌EHA105电击预备处理。

I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。EHA105

II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。1.5ml

III. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。

IV. 重复步骤ⅲ三次。

V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。

（4）电击

I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。

II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。

III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。

IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。8000rpm

精品文档

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感受态细胞的制备步骤和原理

实验目的

为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。

实验原理及过程

实验步骤

1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。

[让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。]

2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约2.5小时。

[减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变精品文档

GAGGAGAGGAFFFFAFAF 异。]

3取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm

4℃离心10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）

[使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。]

4菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2中，轻吹，4℃

30min，4000rpm离心5min弃上清。

[ 细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]

5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。

[除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）] 精品文档

GAGGAGAGGAFFFFAFAF 6 取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL，加入2 uL无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL，加入2 uL阴性对照