IP6诱导HT_29细胞凋亡中线粒体通路的实验研究_张晓妮
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doi:10.3969/j.issn.1008-0341.2009.04.014#论著#[收稿日期]2009-01-12; [修订日期]2009-05-12[基金项目]国家自然科学基金项目(30671767)及山东省自然科学基金项目(2007BS03042)[作者简介]张晓妮(1982-),女,硕士研究生。
E -mail:zhangx-i aoni1982@ 。
[通讯作者]宋扬(1968-),男,博士,教授,硕士生导师。
IP6诱导H T -29细胞凋亡中线粒体通路的实验研究张晓妮1,冷传礼2,宋扬1(1 青岛大学医学院营养与食品卫生研究所,山东青岛 266021; 2 青岛市海慈医院)[摘要] 目的 探讨bc-l 2、细胞色素C(Cy t -C)及Ca 2+参与的线粒体通路在肌醇六磷酸(IP6)诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡过程中的作用。
方法 以3.3mmol/L 的IP 6作用3d 和6个月的H T -29细胞为实验组,以未经IP6作用的H T -29细胞作为对照。
应用RT -P CR 法测定IP6作用不同时间细胞内bc-l 2mRN A 表达的改变,免疫细胞化学法检测细胞内Cyt -C 水平的变化,Fura -2法测定I P6对HT-29细胞内Ca 2+表达的影响。
结果 与对照组相比,IP 6作用组均有效抑制bc-l 2的表达,上调胞浆内Cy t -C 及Ca 2+水平。
结论 在IP6诱导H T -29细胞凋亡的过程中,bc-l 2、Cyt -C 、Ca 2+等因素参与的线粒体凋亡通路可能起到了重要的作用。
[关键词] 植酸;结肠肿瘤;HT-29细胞;基因,bc-l 2;细胞色素C;细胞凋亡[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1008-0341(2009)04-0319-03EXPERIMENTAL S TUDY OF MIT OCHO NDRIAL PATH WAY IN IP6-INDUCED H T -29CELL APOPTO SIS ZH A N G X I A O -NI ,L EN G CH UA N -L I ,S ON G YA N G (Ins titute of Nutrition and Food H ygien e,Qin gdao U niver sity M edical College,Qingdao 266021,China)[AB STRACT ] Obj ective T o investigate the role of mitoch ond rial pathw ay in wh ich bc-l 2,Cytochrome -c (Cyt -C)and Ca 2+participated in inositol hexaph osphate (IP6)induced apoptosis of HT -29human colon carcinoma cell line. Method s H T -29cells w ere ex posed to the sam e concentrations of IP6(3.3mmol/L)for different time:three days or s ix m onths.RT -PCR w as u sed to d etect th e expression of b c -l 2,an d immun ocytochem ical stain used to test th e level of Cyt -C,Fura -2/AM to assay the concentration of intracellular -free calcium. Results Compared w ith th e control group,the different -time IP6effectively decreased expressions of bc-l 2,an d in creased the intracellu lar con cen tration of Cyt -C an d Ca 2+. C onclusion In the process of apoptosis of H T -29cells in duced by IP6,the b c -l 2,Cyt -C,Ca 2+and other factor s play an im portant role in mitochondrial apoptos is pathw ay.[KEY WORDS] Phytic acid;Colonic n eoplasms ;H T 29cell;Gen e,bc-l 2;Cytochromes C;Apoptosis肌醇六磷酸(IP6)又名植酸,易溶于水,其水解产物是肌醇和无机磷酸。
近年来一些研究表明,IP6可能通过调节信号转导,调控细胞周期控制基因、癌基因、抑癌基因而参与细胞增殖和凋亡等重要生命活动,从而发挥抗癌功能[1],但目前有关IP6的抗癌机制尚不清楚。
本实验室以前实验结果证实,1.8、3.0、5.0、8.0及13.0mmo l/L 的IP6均能有效抑制H T -29细胞增殖[2],促进其凋亡。
经IP6作用的H T -29细胞出现明显的形态学改变,而且caspase -3mRNA 表达发生改变[3]。
本实验在以前的实验基础上选取作用较明显的浓度,即3.3m mol/L IP6作用于H T -29细胞,观察其长期作用对H T -29细胞凋亡的影响,探讨Ca 2+、bc-l 2及细胞色素C(Cyt -C)等参与的线粒体凋亡通路在其中的作用。
1 材料与方法1.1 材料来源人结肠癌细胞系H T -29细胞购自北京协和医科大学细胞库,呈单层贴壁生长。
1.2 主要试剂IP6为Sigm a 公司产品;DM EM 、胰蛋白酶、胎牛血清、TRIzol 试剂为GIBCO 公司产品;反转录试剂盒为Promeg a 公司产品。
1.3 主要仪器及设备BNP -310恒温CO 2培养箱为日本T ABAI ES -OEC 公司产品;PCR 仪为Bio metra 公司产品;V-i DAS21图像分析系统由德国欧波同公司生产;天能凝胶图像分析系统由上海天能科技公司生产。
1.4 方法1.4.1 细胞的培养及处理 将H T -29细胞培养于含有体积分数0.10胎牛血清、100mg/L 青霉素和100m g/L 链霉素的DMEM /H am F12培养基中,置37e 、体积分数0.05的CO 2培养箱中培养。
实验组细胞为经3.3mmo l/L IP6作用3d 、6个月的H T-29细胞,以未经IP6作用的相同培养时间的H T-29细胞作为对照。
1.4.2RT-PCR检测细胞内bc-l2mRNA表达的变化半定量RT-PCR实验参照试剂盒说明操作,产物经琼脂糖凝胶电泳并采用图像分析软件Band-Scan5.0比较两条电泳条带的相对吸光度值,获得bc-l2mRNA相对表达量。
引物均由DNAstar软件设计,由上海生工生物技术服务有限公司合成。
1.4.3免疫组织化学法测定细胞内Cyt-C的变化细胞常规消化离心,PBS溶液清洗并调整密度为108/L左右,滴片,冷丙酮固定后,按二步法进行免疫细胞化学染色,DAB显色剂显色,光化学显微镜下观察后封片,显微镜下观察分析。
1.4.4Fura-2法测定IP6对H T-29细胞内Ca2+表达的影响收集细胞,37e水浴10min,加入Fura-2,37e温浴30min。
以含BSA的D-hank液洗涤,调整密度为3@109/L,37e水浴2~3m in。
以激发波波长分别为340nm和380nm,发射波长为500nm,狭缝宽度为5nm,激发时间为1s,测定各管荧光强度,以未负载Fura-2的细胞悬液调零。
测定完毕每管中各加体积分数0.01的Triton r-100裂解细胞膜,再次测定两个激发波波长的荧光强度。
之后在每管细胞悬液中再各加入体积分数0.04的络合剂EGT A,混匀静置后,再次测定两个激发波波长的荧光强度。
并计算Ca2+的浓度[4]。
1.5统计处理实验结果采用PPM S1.5统计软件[5]进行处理,计量资料的比较采用t检验。
2结果2.1细胞内bc-l2m RNA表达的变化图1显示,PCR产物经凝胶电泳鉴定,扩增片段特异性强。
6月时实验组bc-l2表达均较对照组明显降低(t=4.743,P<0.01),且两个实验组之间表现出明显的降低趋势(t=3.162,P<0.01),对照组之间差异无显著性。
见表1。
2.2细胞内Cyt-C的变化实验组细胞内Cyt-C表达与对照组相比差异具有显著性(t=3.834、4.026,P<0.01),且3d组与6月组相比差异也有显著性(t=2.369,P<0.05)。
见表1。
2.3IP6对H T-29细胞内Ca2+浓度的影响实验组作用3d、6月时Ca2+浓度与对照组相比均显著升高(t=2.622、4.317,P<0.01),且6月组明显高于3d组,差异有显著性(t=2.783,P< 0.05)。
见表1。
图1RT-PCR法测定IP6对H T-29细胞bc-l2表达的影响¹为0mmol/L作用3d的bc-l2mRNA的表达;º为3.3mmol/L 作用3d的b c-l2m RNA的表达;»为0mm ol/L作用6月的b c-l2 mRNA的表达;¼为3.3mm ol/L作用6月的bc-l2mRNA的表达表1IP6作用不同时间对HT-29细胞内bc-l2、C y-t C 表达及Ca2+浓度的影响(x?s)组别bc-l2/B-actin值3d6月Cy-t C表达水平(A)3d6月细胞内Ca2+浓度(c/n mol#L-1)3d6月对照组0.15?0.050.15?0.020.23?0.060.26?0.059.58?1.299.20?1.35实验组0.14?0.010.12?0.010.33?0.010.37?0.0421.66?2.1438.66?7.513讨论细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序性的死亡过程,其发生受到机体的严密调控。
不少疾病的发病与凋亡有关。
许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路而达到抑制肿瘤生长的目的。
研究调控肿瘤细胞凋亡的分子机制是目前肿瘤学的重要课题,以药物诱导肿瘤细胞凋亡也被用于新的抗肿瘤药物的筛选。
细胞形态学上的变化是判断凋亡发生最可靠的标准。
