ABO、Rh及MNSs血型鉴定用抗体研究进展来源：本站原创作者：陈琦1张嘉敏2李厚达1朱自严2（1．扬州大学医学院生理教研室，江苏扬州 225001； 2．上…发布时间：2009-12-2红细胞血型系统非常复杂，ABO血型之后，目前已发现了29个血型系统，700余种血型抗原。
血型抗原的正确鉴别在保证输血安全、调查人种分布、建立稀有血型库及许多疾病的诊断、分型甚至治疗方面都有极其重要的作用［1］。
抗原的鉴别有赖于相应抗体的获得。
血型鉴定用抗体的制备也经历了多克隆、单克隆及基因工程抗体3个发展阶段。
现将ABO、Rh及MNSs血型鉴定用抗体研究进展综述如下。
1 ABO血型鉴定用抗体1.1ABO抗血清人源抗血清即多克隆抗体是人体内天然存在的或免疫反应检测到的抗体，ABO血型抗血清属于天然抗体，于出生后2—8个月开始产生，8—10岁达高峰。
将通过全血制备的抗血清用于ABO血型的鉴定，方法简单、血凝明显、特异性强，长期以来一直是国内外血型检测机构及医院使用的ABO定型试剂。
但它们存在的突出问题是：需耗费大量血液、不能做到标准化、难以规模化生产［2］。
基于以上原因，科学家们一直希望找到可代替人抗血清用于ABO血型鉴定的理想试剂。
杂交瘤技术问世，使这一愿望成为现实。
1.2ABO mAbs 1975年杂交瘤技术发明以后，Voak(1980)和Sachs (1981)等先后建立了能分泌抗 A和抗 B mAbs的杂交瘤细胞株，并将其成功用于ABO系统的血型鉴定。
此后，其发展十分迅速，各国均建成了多株能稳定分泌抗 A、抗 B mAbs的瘤株细胞，为保证不同来源的ABO血型mAbs定型试剂质量的稳定性、结果判断的统一性及使用有效性，1987年，国际输血协会(ISBT)在第一届“红细胞及相关抗原单克隆抗体国际专题会议”中，对ABO 血型mAbs制品的生产、使用提出了明确的质量标准和规范［3］。
2000年，我国也出台了相应的政策法规，加强了质量管理与监督。
目前高效价、质量稳定的ABO血型mAbs定型试剂，已完全取代抗血清，广泛用于ABO血型的临床鉴定［4］。
值得注意的是：用mAbs 进行ABO血型鉴定时会有漏检、假阳性、假阴性现象的发生，对此，国内外文献均有报道。
1996年，Garatty等［5］报道了1例使用mAbs定型试剂，误将含获得性B抗原的A型患者错定为AB型，导致患者因错输AB型血死亡的病例；国内孙爱农等［6］也有类似发现。
究其原因，主要是因为不同个体的红细胞A、B抗原，尤其是亚型决定簇的结构和数量存在不均一性，1个mAb只识别1个抗原结合位点，因此用单一mAb制品进行复杂血型鉴定时，可能导致误判。
因此专家建议：可将抗原结合部位不同的mAbs混合组成检测试剂盒，进行复杂血型的鉴定，以确保输血治疗的安全性。
1.3基因工程抗体近年来，基因工程抗体的制备成为抗体工程的重要发展方向。
Siegel 等［7］用噬菌体抗体库技术获得了针对ABO血型抗原的Fab和ScFv抗体，国内王长军等［8］也制备出A抗原的ScFv抗体。
与mAbs相比，这些基因工程抗 A、抗 B在反应亲合力和效价等方面均未达到临床使用的要求，因此，有关这方面的研究进展不大。
2 Rh血型鉴定用抗体在Rh血型系统中，常见的有D、C、E、c、e5种抗原，其中D抗原性最强，因此，一般制备的Rh抗体以抗 D为主。
2.1Rh抗血清与ABO血型系统不同，Rh阴性个体血清中没有天然的Rh抗体。
只有在接受了Rh阳性血后，Rh抗体才能产生。
传统的Rh抗体以Rh阴性志愿者为主要来源，即通过反复注射Rh阳性红细胞以获得高效价的抗血清。
此方法有悖于伦理道德，且获得的抗体来源极其有限，因此，人源Rh抗血清在绝大多数国家已被禁止使用。
2.2Rh mAbs 1975年杂交瘤技术的建立，为Rh抗体的研制带来了极大的希望，但小鼠免疫系统并不识别Rh抗原，这使用传统的杂交瘤技术制备Rh mAbs的种种努力均以失败告终。
经过对单克隆技术的改进，20世纪80年代末，研究人员终于通过3条途径获得了Rh mAbs。
1)人 人、人 鼠杂交瘤技术:将分泌Rh抗体的人B细胞，用杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞或人淋巴母细胞融合，可获得人 鼠或人 人杂交瘤细胞。
人 鼠杂交瘤比人 人杂交瘤的融合率高，细胞生长快，可在裸鼠腹腔内得到高滴度抗体的腹水；但人 人杂交瘤细胞是纯正的人源性mAbs，更适于进行人体治疗。
Boucher等［9］建立的人 鼠杂交瘤细胞系分泌Rh抗体，可用于Rh血型的鉴定。
2)EB病毒转化: 20世纪70年代，Bruggemann等［10］发现EB病毒能感染人B淋巴细胞，使其转化为B淋巴母细胞，并无限期传代。
1987年Dominique等［11］利用此方法获得分泌Rh mAbs的分泌细胞系；Kumper［12］用EB 病毒转化人B淋巴细胞获得了BRAD 3、BRAD 5 2株人源性Rh mAbs，可用于新生儿溶血病的预防。
3)EB病毒转化联合杂交瘤技术:用上述方法制备Rh mAbs的共同缺陷是：瘤株不稳定，易丧失抗体分泌能力。
为此，人们尝试将这2种技术结合，用经EB病毒转化的B 细胞与人或小鼠骨髓瘤细胞系融合，建立可稳定分泌mAbs的瘤株细胞。
Prasad等［13］用该方法获得的1株杂交瘤细胞可稳定分泌Rh mAb，将该抗体注射Rh阴性怀孕妇女用于预防新生儿溶血病时，抗体在体内维持时间较长，疗效稳定，有较大的应用价值。
以上Rh mAbs 制剂必须通过改良技术获得，瘤株的稳定性和效价均较低，这导致其生产成本昂贵，产量有限，远远不能满足临床使用的需要，尤其在我国，目前所用试剂全部依赖进口，输血前无法进行Rh血型的常规检测，这是导致目前临床严重输血反应及新生儿溶血病发生的主要原因。
因此，寻找新途径、新方法制备Rh抗体对保障生命安全十分重要。
基因工程抗体技术的出现为低成本、大规模生产Rh抗体提供了可能。
2.3Rh基因工程抗体技术上，Rh基因工程抗体的制备绕过了单抗制备中动物免疫这一环节，只需Rh抗体阳性人提供少量白细胞，通过单纯的分子生物学技术即可获得。
而在实际应用方面，此类抗体一般为Fab或ScFv形式，它们比mAbs分子量小，能更好地与Rh 抗原结合，因而作为检测试剂它们比mAbs更优越；此外，基因工程抗体的制备周期短、成本低，可实现大规模、标准化生产，以上种种优势促使欧美等国自20世纪90年代起开始投入大量人力、物力开展此项研究，并取得了较大的进展。
在国外，Chang 等［14］先后研制出可溶性RhD的Fab抗体；Miescher等［15］通过筛选，挑出2个表达Fab的高亲和性噬菌体克隆，它们能识别D抗原的变异体，表现出新的抗 D反应形式，并首次在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达，此技术可中试规模生产，有效缓解了Rh抗体极为短缺的压力。
为增强Rh基因工程抗体对红细胞的亲和力，提高其凝集效价，Furuta等［16］利用细菌碱性磷酸酶（BAP)与获得的RhD scFv分子聚合构建（ScFv)2 BAP分子，在BAP抗体存在下, 该分子比带有C myc肽标签的ScFv更易于与红细胞表面的D抗原结合。
Asvadi等［15］则将Rh scFv中的连接肽缩短, 使不同scFv分子间VH 和VL 配对, 在大肠杆菌中表达出的RhD双链抗体能特异结合D抗原, 在交联抗体存在下，它们能凝集木瓜蛋白酶处理过的Rh(+)红细胞, 其结合性能优于ScFv抗体。
在国内:岳建华等［16］获得了1株RhD的ScFv抗体，该抗体用免疫斑点实验证实其与Rh抗原的结合，未做进一步序列分析、可溶性抗体表达和纯化研究。
本实验室则与上海市血液中心血型参比室合作，首次从5个Rh抗体强阳性人的白细胞中，通过噬菌体抗体库技术获得了1株Rh Fab抗体，该抗体与Rh阳性红细胞的凝集活性达2+，其VH属VH3 23亚群家族，Vκ属VκⅢ亚群Ⅸ家族，此抗体可经过基因改造，进一步提高其特异性和亲和力，为最终将Rh基因工程抗体用于临床打下基础。
综上所述，经过近20年的努力，目前文献报道的Rh基因工程抗体已达200余种，其中，一些亲和力高、特异性强的品种已在临床使用。
需要指出的是，Rh基因工程抗体因缺乏Fc段，不能有效参与机体免疫反应，只能用于Rh血型检测，而不能输入母体预防新生儿溶血病的发生。
3 其它血型鉴定用抗体除上述ABO及Rh血型系统外，对其它27个血型系统的mAbs及基因工程抗体的制备多集中在MNSs、Diego、kell、Duffy、Gerbich、cromer等几个系统，它们制备方法及手段相似，这里简单介绍MNSs血型抗体的制备。
MNSs血型系统涉及GPA、GPB 2种蛋白，它们是人红细胞膜上的主要糖蛋白，两者有60%的同源性。
GPA根据其第1和第5位氨基酸的差异分别形成M和N抗原，而GPB则根据其第48位氨基酸的不同形成S和s抗原，故该血型系统被称为MNSs血型系统［17］。
GPA、GPB是红细胞膜上数量最多，抗原性最强的蛋白，据报道：在用红细胞直接免疫小鼠获得的血型mAbs中，70%以上属于此血型mAbs，其中获得的GPA mAbs数量远多于GPB，但没有作用于GPA、GPB蛋白同源部分的GPA/GPB mAbs的报道［18］。
本实验室［19］在前期工作中获得了1株GPA/GPB mAb，它与红细胞凝集反应达4+、小鼠腹水效价为1×2-12，其特异性强、效价高，有很好的临床使用及进一步研究的价值。
MNSs血型mAbs的应用虽然在临床输血方面意义不大（由该血型不合引起输血反应及新生儿溶血病的发生率远小于ABO及Rh血型系统），但它们在鉴别MNSs稀有血型、判断辐射损伤、基因突变监测及法医鉴定等方面则有很重要的应用价值。
此外，获得了MNSs血型mAbs后，还可通过分子生物学技术进一步构建双功能分子，用血凝反应进行病原或抗体的快速检测，其原理为：通过对表达MNSs血型mAb的杂交瘤细胞进行RNA抽提测序，获得其重、轻链基因，将其组装成ScFv后与某个抗原或抗体分子基因融合表达双功能蛋白，因GPA、GPB存在于所有红细胞膜上，这样，可通过简单的血凝反应实现病原体或抗体的快速检测。
Lilley等［20］将GPA的ScFv基因与HIV抗原基因融合表达，产生的双功能蛋白能通过红细胞凝集实验快速进行HIV的临床诊断。
陈宇萍等［21］根据此原理构建的抗红细胞 抗HBsAg双功能分子,可使红细胞在与HBsAg 混合时产生肉眼可见的血凝现象。
本实验室在前期工作中用GPA/GPB mAb的ScFv抗体与人乳头瘤病毒基因片段（HPV16 E7）拼接获得了具有红细胞凝集活性的双功能分子，为HPV 病毒的检测提供了一条新途径。
