植物五种酶活性检测方法

禾本科植物谷胱甘肽氧化物酶的活性测定摘要：本文以羊草的叶片和根为材料, 用0. 2 mo l /L pH 6. 2的磷酸缓冲液( 含1 mmo l/L EDTA-2Na，5%的水溶性PVP)作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH一PX）的提取介质，偏磷酸为酶促反应的蛋白质沉淀剂, 二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB ) 与GSH显色反应3min, 在412 nm测定酶管和非酶管的OD值, 以测定谷胱甘肽过氧化物酶的活性关键词：盐碱胁迫；羊草；GSH-PX；酶活性Analyzing Soluble Sugar Content and Biomass of Sweet Sorghumunder Saline-alkali StressAbstract:Soil salinization is a global issue. Experiments prove that growing state of sweet sorghum shows growth inhibition，lower production and physiological disorders under soil salinity In this study,sweet sorghum as our material，was sowed in neutral soil and saline soil, respectively，exploring characteristics of salinity stress for the sweet sorghum and the change of soluble sugar and biomass. According to the particularity of different soils，we observed the relationship between different varieties and salt-alkali stress at different growth stages.Profound understanding of physiological mechanism of sweet sorghum response to salt-alkali stress for screening sweet sorghum germplasm,identifying salinity tolerance and cultivating the new sweet sorghum species is significance.Keywords: Salt stress; sweet sorghum; Glutathione peroxidase; enzyme actirityⅠ1前言植物是一个需氧代谢的有机体。

Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seeding方法1测定土壤及植物水状况（1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。

在DAP（开花后的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦化前称重。

（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。

（3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。

在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。

Notice 1RWC计算：RWC=（W f－W d）／（W t－W d）×100%2WC计算：WC=（W f－W d）／W f×100%W f：叶片鲜重；W d：叶片干重；W t：叶片吸水饱和时的重量。

2酶粗提液的制备为了测定CA T，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟15000g，4℃，离心20min→取上清。

上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。

为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，离心15min→取上清。

上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。

试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。

3酶活性的测定所有的分光光度分析都使用Hitachi U-2000型分光光度计。

植物体内转化酶活性的测定转化酶又称蔗糖酶(β—D—呋喃型果糖苷一果糖水解酶)，是一种水解酶。

植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。

它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。

所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。

【原理】转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。

将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。

在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

通常，在测定过程中，溶液的pH对酶活性影响很大。

不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH值。

转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa约为7，另一个PKa约为3。

不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH也不同(最适pH在7.0左右的为中性转化酶，最适pH在7.0以下的为酸性转化酶)。

所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH值。

【材料、仪器与试剂】1．材料：植物组织2．试剂：（1）提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl (PH7.0) 缓冲液，内含5 mmol/L MgCl2,2 mmol/L EDTA-Na2,2% 乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSA），2%PVP，5 mmol/LDTT 。

（2）透析缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl (PH7.0) 缓冲液，内含2.5 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EDTA-Na2,1% 乙二醇，1 mmol/L DTT。

生化实验报告单位：学号：姓名：实验1.多酚氧化酶（PPO）的分离提取一、实验原理与目的氧化形成为醌，使组织形植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。

多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。

本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。

通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。

二、实验材料与试剂1.材料：马铃薯（大约每小组100-200g）2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配×10倍浓缩液100ml；0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml； NaCl；聚乙二醇： DEAE－纤维素 DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200:三、实验步骤（1）粗酶提取：马铃薯丁按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。

（2）盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M 巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。

硝酸还原酶的测定方法硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。

红色的偶氮染料。

反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。

增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。

这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。

仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。

0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。

磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。

α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。

NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。

然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。

操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。

然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。

将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。

植物脱氢酶(PDHA)活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号:BC3125规格:100T/48S产品内容：试剂一：粉剂×2瓶。

使用前加少量水溶解，定容至50mL，避光、4℃保存（尽量现配现用）。

试剂二：液体100mL×2瓶，4℃保存。

试剂三：乙酸乙酯，自备。

产品说明：生物体的脱氢酶(Plant dehydrogenase,PDHA)的活性在很大程度上反映了生物体的活性状态，能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。

受氢体2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，即TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，其还原产物三苯基甲替（TriphenylFormazone，即TFF）呈现红色，在波长485nm处有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm测定其吸光值，即得植物脱氢酶活性。

试验中所需的仪器和试剂：台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯/聚丙烯材质）、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水、乙酸乙酯（不允许快递，请用户自备）。

操作步骤：一、样品处理：称取0.1g的植物组织，用双蒸水清洗3-4次，用滤纸吸干水分，备用。

二、测定步骤：1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至485nm，乙酸乙酯调零。

2、操作表：取5mLEP管依次加入对照管测定管样品（g）0.10.1试剂一（mL）1试剂二（mL）21充分混匀，37℃，暗培养3h，取出后立即冰浴5min，去滤液，尽量用滤纸吸干样品，置于研钵/匀浆器中。

试剂三（mL）11充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至于离心管中，用少量试剂三冲洗研钵，一起加入离心管，用试剂三定容至2mL，10000rpm/min，4℃，离心5min，取200μL上清至微量玻璃比色皿或96孔板中，测定485nm下的吸光值。

一、名词解释诱变育种:利用诱变剂处理微生物细胞, 提高基因突变频率, 再通过适当的筛选方法获得所需高产优质菌种的方法。

代谢控制发酵:是指利用生物的、物理的、化学的方法, 人为的改变微生物的代谢途径, 使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。

寡核苷酸介导诱变( ):指在水平上改变氨基酸的编码序列, 也称定点诱变( );补料分批培养:在分批培养过程中补入新鲜的料液, 以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。

临界溶氧浓度:指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。

诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成, 当加入诱导物后就会大量合成, 这样的酶叫诱导酶固定化酶:通过物理的或化学的方法, 将酶束缚于水不溶的载体上, 或将酶束缚于一定的空间内, 限制酶分子的自由流动, 但能使酶发挥催化作用的酶.非水酶学:通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的, 研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学.抗体酶:是一种具有催化作用的免疫球蛋白, 属于化学人工酶细胞培养:是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长, 此时细胞不再形成组织．愈伤组织:在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

接触抑制:细胞从接种到长满底物表面后, 由于细胞繁殖数量增多相互接触后, 不再增加。

细胞系:原代细胞经第一次传代后, 形成的细胞群体, 即具有增殖能力, 类型均匀的培养细胞, 一般为有限细胞系。

抗性互补筛选法:利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂与其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。

细胞拆合:是指以一定的实验技术从活细胞中分离出细胞器与其组分, 然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器与其组分进行重组, 使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器.基因重组 ( ):是指片段在细胞内、细胞间, 甚至在不同物种之间进行交换, 交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。

克隆:来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

限制性内切酶:限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶, 能将外来的切断, 由于这种切割作用是在分子内部进行的, 故名限制性内切酶。

欢迎阅读选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。

1、多酚化酶（Polyphenoloxidase ，PPO ）活性的测定适量茶鲜叶（3g ）,料液比1:2，加入内含5%PVP （w/v ）经遇冷的pH 为7.2的柠檬酸-，取上取 1.2ml （（37℃恒合液。

0.01为2离心20min 取酶提取液0.2ml ，加入由硼酸钠缓冲液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml 蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min ，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。

PAL 的酶活性以每小时在290nm 处吸光度变化0.01OD 为一个活力单位。

3、脂氧合酶(linoleate:oxygenoxidoreductase ，LOX )活性的测定取0.2g新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（pH7.6）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。

4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。

Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。

4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法）取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/LPH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[取2-3ml5分ΔA470积（ml，5取（含1%PVP12h。

1000r/min离心20min,得到酶初提液。

取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。

取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。

（测定30s读数一次，5分钟）。

酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。

萌发麦种淀粉酶活⼒的测定实验⼆萌发麦种淀粉酶活⼒的测定⼀、实验背景及⽬的⽲⾕类作物作为最重要的粮⾷作物，对其种⼦技术的研究对于提⾼我国种业发展⽔平、保障国家粮⾷安全有重要意义。

【1】休眠的种⼦中只有β-淀粉酶，萌发时胚释放出来的⾚霉素能诱导糊粉层细胞中α-淀粉酶基因的表达，引起α-淀粉酶⽣物合成，分泌到胚乳中。

【2】两种酶共同催化淀粉⽔解为糖，为细胞分裂以及细胞⽣长提供原料。

【3】【4】本实验通过测定萌发麦种淀粉酶活⼒，更好的了解酶在⽣物代谢中的作⽤。

⼆、实验原理淀粉是植物最重要的贮藏多糖，也是⼈和动物的重要⾷物和发酵⼯业的基本原料。

淀粉经淀粉酶作⽤后⽣成葡萄糖、麦芽糖等⼩分⼦⽽被机体利⽤。

淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，在⽲本科植物萌发过程中，这两种酶的活性最⾼。

【5】α-淀粉酶可随机地作⽤于淀粉中的α-1,4-糖苷键，⽣成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此⼜称为液化酶。

β-淀粉酶可从淀粉的⾮还原性末端进⾏⽔解，每次⽔解下⼀分⼦麦芽糖，⼜被称为糖化酶。

【6】【7】研究发现他们各有其⼀定的特性：α-淀粉酶不耐酸，在 pH3.6 以下则发⽣钝化；β-淀粉酶不耐热，在⾼温下易钝化。

利⽤不同特性，钝化其⼀，即可测定另⼀种酶的活性。

测定α -淀粉酶活性时，可将提取液加热到70°C 维持 15 分钟来钝化β-淀粉酶；【8】【9】⽽测定β-淀粉酶时，可⽤ pH3.6 的醋酸缓冲液处理提取液，以钝化α-淀粉酶。

实验应该严格把控钝化条件。

淀粉酶活⼒的⼤⼩与产⽣的麦芽糖量成正⽐，可⽤ 3,5-⼆硝基⽔杨酸法进⾏测定。

还原糖和碱性⼆硝基⽔杨酸试剂共热，产⽣⼀种棕红⾊的氨基化合物。

⽤实验体系中单位时间内⽣成的麦芽糖毫克数表⽰淀粉酶活⼒的⼤⼩。

在实验中要严格控制温度及时间，保证酶的最适条件及初速度状态，以减⼩实验误差。

【10】【11】本次实验分为两部分，⼀是通过纯化β-淀粉酶活⼒完成α-淀粉酶的活⼒测定，⼆是不进⾏任何钝化处理测定总酶活⼒。

实验五SOD活性的测定一、实验目的学习并掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理和操作方法。

二、实验原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

测定SOD活性的方法很多，简便且常用的是NBT(氮蓝四唑)光还原法。

该方法的原理是超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

当反应体系中有可被氧化的物质存在时，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧气，氧气被单电子还原产生氧自由基，氧自由基则可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除氧自由基，当反应体系中有SOD存在时可抑制NBT的还原，于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

因此可通过测定A560来计算SOD的活性，以抑制NBT 光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。

三、实验材料、试剂与仪器1.实验材料：小白菜叶片。

2.实验试剂：（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；（4）100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（5）20μmol/L核黄素溶液：100μmol/L核黄素溶液稀释5倍即实验所需的20μmol/L核黄素溶液；（6）SOD提取介质：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、3.实验仪器：高速台式离心机，可见分光光度计，光照培养箱，专用试管，研钵等。

四、实验步骤1、粗酶液提取将小白菜叶片放置在冰箱中冷处理3min，用作胁迫对照。

植物组织中可溶性糖含量的测定在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。

它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。

由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。

Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。

但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。

此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。

糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620 nm ，故在此波长下进行比色。

二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物鲜样或干样。

（二）试剂1. 80 ％乙醇。

2. 葡萄糖标准溶液（100 μg/mL ）：准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100 mL ，使用时再稀释10 倍（100 μg/mL ）。

一、绪论1、生物催化：利用酶或有机体（细胞或细胞器）等）作为催化剂实现化学转化（通常是加快）的过程。

2、生物催化与发酵：1、发酵：用活细胞，将原材料转化成更复杂的目标产物。

2、前体发酵：发酵过程中添加前体物质，并有活细胞将其转化为目标产物。

3、生物转化：用酶或静息细胞经过一系列步骤，将前体转化成目标产物。

4、生物（酶）催化：提取酶或部分纯化的酶，将底物转化成目标产物。

3、酶工程：应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。

是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。

4、酶工程研究内容：（一）酶的生产（二）化学酶工程（三）生物酶工程（四）酶反应器（五）酶反应介质（六）酶的应用5、酶反应器：活塞流反应器全混流反应器流化床反应器固定床反应器膜反应器二、酶学概述6、酶的分类：（一）按酶催化反应的类型分类1、氧化还原酶2、转移酶3、水解酶4、裂合酶5、异构酶6、连接酶（合成酶）1．氧化还原酶: 催化氧化-还原反应，转移氢或加氧。

主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)、过氧化氢酶、氧合酶、细胞色素氧化酶。

例如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应2、转移酶: 转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

参与生物物质的代谢.(例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。

) 3、水解酶:水解酶催化底物的加水分解反应（或逆反应）。

主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。

例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应。

4、裂解酶：裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。

5、异构酶：此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等，分为差相异构酶、消旋酶、顺反异构酶等。

6、连接酶（合成酶）：能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。

生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ·技术与方法·２００７年第５期收稿日期：２００７－０３－３０基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０６７１２４４）；植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题资助项目（Ｎｏ．ＰＰＢ０４００６）；河北省自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０３１８０；Ｎｏ．Ｃ２００５０００２２０）作者简介：祁艳（１９８１－），女，山西人，硕士，研究方向：植物抗病生理通讯作者：王冬梅，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｍｅｉｗａｎｇ６３＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ由于活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）具有很高的反应活性，它们可以与许多不同的化合物发生反应，根据反应生成物或者反应物的变化程度可以间接地对ＲＯＳ进行定量或者定性分析。

通常采用的方法有化学发光法、紫外－可见吸收分光光度法、荧光染色法及ＤＡＢ组织染色法等，电子显微技术检测法也受到研究者的青睐。

活体中ＲＯＳ的直接检测对于解释生命机体的各种生理反应有着重要的意义。

目前能够用于解决该问题的方法比较有限，已报道的有电子顺磁共振技术（ｅｌｅｃｔｒｏｎｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＰＲ），又称电子自旋共振技术（ｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｉｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＳＲ）。

ＥＰＲ是一种检测自由基的波谱学方法，可以直接检测Ｏ２－·，·ＯＨ等活性氧自由基及参与其形成的过渡金属离子的化学变化［１，２］，因此该法受到植物界工作者的广泛关注。

下面对目前实验室中所用到的检测植物体内ＲＯＳ的方法逐一进行介绍。

１植物体内ＲＯＳ的检测方法１．１化学发光法化学发光法是活性氧检测中常用的实验技术，其原理是化学发光试剂与活性氧反应生成激发态的产物，产物中的电子经非辐射性跃迁回到基态而放出光子。

常用的化学发光试剂有鲁米诺（ｌｕｍｉｎｏｌ）、光泽精（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）、甲壳动物荧光素（如海萤荧光素）等。

植物五种酶活性检测方法本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点(0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。

1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。

取200ml初酶液，加入L柠檬酸-磷酸盐缓冲液200uL,混合反应液（L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素终止反应，460nm波长测吸光度。

对照为不加邻苯二酚的反应混合液。

酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加为一个活性单位。

2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定称取新鲜样品于预冷研钵中，加入6ml L（）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。

混匀后在4℃冰箱中浸提4h。

4℃10000r/min离心20min，取上清液即为酶提取液。

取酶提取液，加入由硼酸钠缓冲液配制的L L-苯丙氨酸，蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。

PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化为一个活力单位。

3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定取新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。