下拉实验流程图 (1)
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Pull-down法筛选转录因子靶基因的流程图
酶切10g基因组DNA
5gDNA片段 10g
双链接头
接头—DNA片段(纯化) 结合蛋白
结合蛋白—接头—DNA复合物
单克隆抗体及Protein A
免疫沉淀(结合蛋白—接头—DNA复合物)
CI出去蛋白
接头—DNA片段
PCR扩增
大量的接头—DNA片段
酶切接头
DNA片段
克隆
送公司测序
相关软件比对及数据库分析
获得靶基因的整个序列
EMSA
验证转录因子与靶基因的相互作用
具体步骤:
1制备连有接头的DNA片段
(1)限制性内切酶酶切10g植物基因组DNA
基因组DNA片段
(2) 5 gDNA片段与10 g双链接头链接(T4DNA连接酶, 16℃
过夜) 接头--DNA片段
(3)通过1%琼脂糖凝胶电泳将接头--DNA片段与未连接接头的DNA片段分离
(4) 切胶回收接头--DNA片段
(5) 纯化接头--DNA片段
2免疫沉淀与结合蛋白有相互作用的接头--DNA片段
(1) 20L的反应体系:2L10×结合缓冲液;1g接头--DNA片段; 5g纯化结合蛋白;1g单克隆抗体; 0.5gpoly-dIdC ,混匀后冰上放置20min;
(2) 然后加入120L蛋白A beads继续在冰上孵育20min,每隔5min轻摇一下;
(3) 14,000g离心30 s , 去上清,用TN缓冲液洗两次 ,获得免疫共沉淀复合物;
(4) 接着用裂解缓冲液120 L重悬沉淀 ,14,000g离心1min,除去蛋白;
(5) 再用酚︰氯仿(1︰1)纯化DNA 片段,再用75%乙醇洗涤 一次,12000r/1min,去上清;
(6) 室温晾干后,用10LddH2O重悬接头--DNA片段沉淀。 3对筛选的接头--DNA片段进行PCR扩增, 产物经琼脂糖凝胶电泳回收
4对接头--DNA片段进行恢复(酶切去接头) DNA片段
5克隆DNA片段至pMD19-T上
6送测序
7相关软件及数据库分析获得靶基因整个序列
8对筛选的靶基因进行验证(EMSA)
注意事项:
1 为了避免酶切产物(单酶切)自身环化,对酶切产物进行去磷酸化;
2 为了防止结合蛋白与接头—DNA片段非特异性结合,用poly-dIdC处理
3 最好对结合蛋白进行纯化及使用单抗
4减少非特异性扩增,PCR循环次数不能少于3次。
附录:
1 DNA 结合缓冲液:
20mmol/L Tris-Cl(p H 7.6)
50mmol/L NaCl
1mmol/L MgCl2
0.2mmol/L EDTA
0.5mmol/L DTT
0.05mmol/L PMSF
5% 甘油 TN缓冲液:
10mmol/L Tris-Cl(p H 7.5)
50mmol/L NaCl
裂解缓冲液:
500mmol/L Tris-Cl(p H 9.0)
20mmol/L EDTA
10mmol/L NaCl
0.2% SDS