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pcDNA3.1(+)-ABCG2真核表达载体的构建与鉴定

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肝胆外科杂志２０１３年４月第２１卷第２期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ，２１，Ｎｏ．２，Ａｐｒ．２０１３　１３７　

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＡＢＣＧ２真核表达载体的构建与鉴定　

罗维欢　，江春平　，丁义涛　

【摘要】　目的构建人的ＡＢＣＧ２基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＡＢＣＧ２，并在ＡＢＣＧ２阴性ＳＭＭＣ７７２１肝癌细胞中　表达。方法以人的癌细胞为材料提取ＲＮＡ，经反转录得到ｃＤＮＡ，利用ＰＣＲ方法，根据人ＡＢＣＧ２基因６２５２６０３２（ＮＭ一　

００４８２７．２）序列信息设计引物，扩增ＡＢＣＧ２基因的ＣＤＳ序列，将其克隆到ｐｃＤＮＡ３．１＋表达载体中。酶切及测序鉴定重组质　

粒正确后，脂质体介导转染至ＡＢＣＧ２阴性ＳＭＭＣ７７２１肝癌细胞中。采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测外源基因ＡＢＣＧ２的表达。结果　

ＰＣＲ扩增片段大小与理论片段大小相符，酶切大小与理论大小相符，阳性的克隆测序鉴定正确，表明人ＡＢＣＧ２基因克隆及　

真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＡＢＣＧ２构建成功。在蛋白水平，转染７２ｈ后的细胞中外源基因ＡＢＣＧ２表达均明显增加。结论　

成功构建重组真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＡＢＣＧ２，并在ＡＢＣＧ２阴性ＳＭＭＣ７７２１肝癌细胞中进行了表达。　

【关键词】　真核表达载体；ＡＢＣＧ２阴性ＳＭＭＣ７７２１肝癌细胞；ＡＢＣＧ２　

【中图分类号】Ｒ　７３５．７　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１００６－４７６１（２０１３）０２－０１３７－０４　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＡＢＣＧ２　（ＬＵＯ　Ｗｅｉ－ｈｕａｎ　，ＪＩＡＮＧ　Ｃｈｕｎ—　

ｐｉｎｇ　，ＤＩＮＧ　－ｔａｏ　１．Ｎａｎｆｉｎｇ　Ｕｎ＆ｅｍｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｎａｎｆｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ　２１０００８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａ￣ｍｅｎｔ　ｏｆＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｒｇｅ￣　Ｙ，ａｆａ　ｌｉａｔｅｄＤｒｕｍ　ＴｏｗｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＮａｎｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ　２１０００８，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＡＢＣＧ２　ｇｅｎｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｃＤＮＡ３．１（＋）・ＡＢＣＧ２，ａｎｄ　ｅｘ—　

ｐｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｔｈｅ　ＡＢＣＧ２　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ＳＭＭＣ７７２１　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄ　ＲＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ，ｖｉａ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ—　

ｔｉｏｎ　ｃＤＮＡ　ｂｙ　ＰＣＲ，ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ＡＢＣＧ２　ｇｅｎｅ　６２５２６０３２（ＮＭ＿００４８２７．２），　ＣＤＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＡＢＣＧ２　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｃＤＮＡ３．１＋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｐｌａｓｍｉｄ　

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＡＢＣＧ２　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＡＢＣＧ２　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ＳＭＭＣ７７２１　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ．Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　Ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　

ｃｅｒｔｉｆｙ　ｗｈｅｔｈｅｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｔｈｅ　ＡＢＣＧ２　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ＳＭＭＣ７７２１　ｏｆ　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇ—　

ｍｅｎｔ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｗａｓ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ　ｒｅｓｕｌｔ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｉｎ　ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｓｉｚｅ．Ｔｈｅｒｅ－　

ｆｏｒｅ，ｔｈｅ　ＡＢＣＧ２　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐｃＤＮＡ３．１（＋）一ＡＢＣＧ２　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ－　

ｌｙ．Ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＡＢＣＧ２　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｃｏｎ－　

ｃｌｕｓｉｏｎ　Ｗｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ＡＢＣＧ２，ａｎｄ　ｉｔ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ＡＢＣＧ２　ＳＭＭＣ７７２１　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．　

【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ；Ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ＡＢＣＧ２　ＳＭＭＣ７７２１　ｈｅｐａｔｏｍａ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ；ＡＢＣＧ２　

ＡＴＰ结合盒膜转运蛋白Ｇ２（ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ　ｔｒａｎｓ－　ｐｏｒｔｅｒ，Ｇ２　ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，ＡＢＣＧ２）是ＡＢＣ（ＡＴＰ．ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）　

转运蛋白超家族成员之一，可将包括各种化疗药物泵出细胞　外”　，ＡＢＣＧ２基因也称之为乳腺癌耐药蛋白（ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＣＲＰ）基因　。我国肝癌的发病主要由于　

乙型病毒性肝炎引起，在我国恶性肿瘤发病率中肝癌发病率　居第２位　Ｊ。诸多实验显示，ＡＢＣＧ２在包括肝细胞癌（Ｈｅｐ—　

ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ．ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）的多种肿瘤组织中存在差异性表　达，且与患者的个体预后直接相关；我们前期研究也证实，　ＡＢＣＧ２在６３％的ＨＣＣ组织中存在高表达，表达强度与脉管　

【基金项目】江苏省南京市卫生局科技发展基金资助项目（项目编　号：ＺＫＸ０８０２５）；卫生部科研课题（江苏省）（项目编号：　ＬＷ２０１００８）　．　【作者单位】１．南京大学医学院，南京２１０００８　２．南京大学附属鼓楼医院肝胆外科　【通讯作者】丁义涛。　癌栓呈正相关　Ｊ，由于肝癌细胞对于传统放化疗存在较强的　

耐药性，因此全身放疗和化疗疗效一直较差，成为ＨＣＣ最终　

治疗效果不理想的重要原因。目前众多实验已经证实，肿瘤　

细胞表达的多种转运蛋白是引起ＨＣＣ对放化疗耐药的关键　

原因之一。阿霉素和５一氟尿嘧啶（５－ＦＵ）常用于治疗ＨＣＣ，　

而ＡＢＣＧ２作为转运蛋白通过主动外排阿霉素和５－ＦＵ及其　活性代谢产物，大大降低化疗药物在肝癌细胞中的有效浓　

度，可能是造成肝癌细胞发生化疗耐药的原因　，我们的前　

期研究也表明，肝癌细胞系内ＡＢＣＧ２阳性细胞越多，则肿瘤　

细胞对于化疗药物抗性越强　。本实验以人的癌细胞为材　

料提取ＲＮＡ，经反转录得到ｃＤＮＡ，利用ＰＣＲ方法，根据人　

ＡＢＣＧ２基因６２５２６０３２（ＮＭ一００４８２７．２）序列信息设计引物，　

扩增ＡＢＣＧ２基因的ＣＤＳ序列，并将其克隆到ｐｃＤＮＡ３．１＋　表达载体中。经过酶切及测序鉴定重组质粒正确后，利用阳　

离子脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００介导转染至ＡＢＣＧ２阴性　

ＳＭＭＣ７７２１肝癌细胞中，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌ

ｏｔ法检测外源基因　１３８　肝胆外科杂志２０１３年４月第２１卷第２期Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ，２１，Ｎｏ．２，Ａｐｒ．２０１３　

ＡＢＣＧ２的表达，为下步研究上调ＡＢＣＧ２表达后对肝癌细胞　生物学行为的影响奠定了基础。　

１材料与方法　

１．１主要材料　

ＬＢ培养基：蛋白胨（ｔｒｙｐｔｏｎｅ），酵母提取物（ｙｅａｓｔ　ｅｘ—　

ｔｒａｃｔ）ＯＸＯＩＤ公司（英）；限制性内切酶（ＴａＫａＲａ）；质粒小提　取试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ　

ＤＮＡ聚合酶ＴａＫａＲａ公司；琼脂糖西班牙ＢｉｏＷｅｓｔ公司；　

ＤＮＡ凝胶纯化试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；ＤＮＡ　

产物纯化试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；连接反应　

液ＴａＫａＲａ公司；普通ＤＮＡ聚合酶ＴａＫａＲａ公司；ＤＨ５ｃ￣感　

受态细胞天根生化科技（北京）有限公司；鼠抗人ＡＢＣＧ２单　

克隆抗体购自Ａｂｃａｍ公司；羊抗小鼠ＩｇＧ抗体购自南京布　克生物科技；ＥＣＬ发光试剂盒购自美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；Ｌｉ—　ｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅＴＭ２０００　Ｏｐｔｉ．Ｍｅｍ引物合成：广州市锐博生物科　

技有限公司；序列测定：北京六合华大基因科技股份有限公　

司；人肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１南京凯基生物科技发展有限　

公司，ＡＢＣＧ２阴性ＳＭＭＣ７７２１细胞由本实验室焦洪波硕士　

通过流式细胞分选后传代培养并冻存于液氮中。　

１．２　方法　１．２．１　以人的癌细胞为材料提取　

ＲＮＡ，经反转录得到ｃＤＮＡ，利用ＰＣＲ方法，根据人ＡＢ—　

ＣＧ２基因６２５２６０３２（ＮＭ＿００４８２７．２）序列信息设计引物，扩增　

ＡＢＣＧ２基因的ＣＤＳ序列，将其克隆到ｐｅＤＮＡ３．１＋表达载体　中。具体步骤如下：　

（１）基因序列分析：对基因序列及载体序列分析，可以利用　

ＢａｍＨＩ，ＥｅｏＲＩ两个限制性内切酶将目的基因片段克隆到载　

体中，载体图谱（见图１）　

（＋）．　壅塞　鎏透　

㈠　

图１载体图谱　

设计扩增引物如下：　

ＡＢＣＧ２一ＣＤＳ—Ｆ：５　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴｒＣＣＡＧＴＡＡＴ．　Ｇ．Ｉ’ＣＧＡＡＧＴ　３　ＡＢＣＧ２一ＣＤＳ—Ｒ：５　ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴｒＡＡＧＡＡ　ＴＡＴｍ—　

ＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＡＴＩＴＩ’ＣＡＧＧ　３　加黑斜体分别为ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ酶切位点序列，之前序　

列为保护碱基，引物扩增总长度为１９８６　ｂｐ。　

（２）ＰＣＲ　反应体系设计为３０　ｌ总体系，具体是５×Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　

Ｂｕｆｆｅｒ　６　ｌ，２．５ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ　２　Ｉｘｌ，上下游引物（１０ｍＭ）各１　

ｔｒｌ，ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ　ＤＮＡ聚合酶（２．５　Ｕ／ｉｘ１）０．３　１，ＤＮＡ模板　

１　ｌ（约１００　ｎｇ），用灭菌水补足３０　ｌ体系。反应条件为（降　

落ＰＣＲ）：９５℃５ｍｉｎ预变性，循环内９８￣Ｃ　１０　ｓ变性，从６５￣Ｃ　

每个循环降１℃退火，７２ｃＣ延伸１　ｍｉｎ　２０　；１０个循环；在　

５５℃退火，进行１８个循环；ＰＣＲ反应循环后７２￣Ｃ继续延伸　

７ｍｉｎ，然后４℃保存。　

（３）ＰＣＲ产物的纯化　

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pCDNA 3.1／ EC—SOD真核载体的构建及在巨噬细胞中的表达

pCDNA 3.1／ EC—SOD真核载体的构建及在巨噬细胞中的表达

pCDNA 3.1／ EC—SOD真核载体的构建及在巨噬细胞中的表达

目的 为明确EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用，课题组体外构建pCDNA 3.1/EC-SOD真核表达载体，并观察其在THP-1单核源性巨噬细胞中的表达情况。方法 重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后，借助Lipofectamine 2000将转染到THP-1单核源性巨噬细胞中，24h后倒置荧光显微镜下观察转染情况。结果 重组质粒经酶切鉴定、PCR和测序分析后，证实pCDNA

3.1/EC-SOD质粒构建成功。将pCDNA 3.1/EC-SOD通过脂质体转入THP-1单核源性巨噬细胞后，倒置荧光显微镜下观察转染效率。结论 pCDNA 3.1/EC-SOD载体构建成功，并成功在THP-1单核源性巨噬细胞中表达，为研究EC-SOD在动脉粥样硬化发生发展中的作用奠定了基础。

标签：EC-SOD；THP-1单核源性巨噬细胞

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是体内重要的抗氧化防御系统，包括铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）以及最近日益得到重视的细胞外超氧化物歧化酶（ECSOD）[1]。EC-SOD是Marklund等在1982年发现的一种分泌型糖蛋白，主要由巨噬细胞和血管平滑肌细胞产生，它是惟一分布在细胞外发挥抗氧化作用的酶，对机体的氧化/抗氧化平衡起至关重要的作用[2，3]。EC-SOD可以清除脂质过氧化物、减轻氧自由基对组织细胞的过氧化损伤，并能降低脂质过氧化物形成，从而保护血管内皮免受氧自由基的损伤，防止动脉粥样硬化（Atherosclerosis， AS）的形成[4，5]。为了更深层次的研究EC-SOD的作用机理，我们构建了PcDNA-3.1/EC-SOD真核表达载体，并成功转染了THP-1单核源性巨噬细胞，为进一步研究EC-SOD的作用奠定了基础。

真核表达载体pcDNA3-CaBP—D28k的构建及其在COS-1细胞表达

真核表达载体pcDNA3-CaBP—D28k的构建及其在COS-1细胞表达

江苏农业科学２００８年第３期　

真核表达载体ｐｃＤＮＡ３一ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ的构建　

及其在ＣＯＳ一１细胞表达　

俞路，章世元，王雅倩，李燕舞，李治学，严桂芹，周联高　

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州２２５００９）　

摘要：通过酶切方法从克隆质粒ｐＧＥＭ—Ｔ—ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ中扩增ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ基因，并将其克隆到真核表达　

载体ｐｃＤＮＡ３中。阳性克隆鉴定后，在ＰＥＩ作用下转染ＣＯＳ一１细胞，通过间接免疫荧光试验（ＩＦＡ）检测到了　

ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ在ＣＯＳ一１中的表达。　

关键词：钙结合蛋白；转染；ＩＦＡ　

中图分类号：￥８３１．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２（２００８）０３—００６２—０５　

钙结合蛋白ｃａｌｂｉｎｄｉｎ—Ｄ２８ｋ（ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ）是　

存在于真核细胞浆的一种可溶性蛋白质，属于钙结　

合蛋白家族中的一员。它是一种维生素Ｄ依赖性　

钙结合蛋白，是受活性维生素Ｄ及其代谢产物调节　

的细胞内蛋白质，相对分子质量为２８×１０　Ｄａ，具有　

Ｅ—Ｆ手臂，呈螺旋环状结构，可与Ｃａ　结合，直接　

调节Ｃａ　转运　－２］。ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ与细胞内游离钙　

离子有高度亲和力，可介导调节钙离子参与的多种　

生理功能　－４］。ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ首先是从禽肠道中分　

离出来的，它的含量与肠钙吸收量呈正相关　Ｊ。　

以往对ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ的研究多集中在与钙平衡密切　

相关的肾、骨、小肠、神经系统方面　，近年来研　

究显示ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ在雌性生殖过程中也具有重要　

作用　１２］。ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ与鸟类、禽类卵的石灰化有　

关，多项研究观察到鸡子宫中有ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ表达，　

而且其表达变化与蛋壳的形成过程密切相关　１　Ｈ］。　

此外在产蛋母鸡的输卵管中也检测到了ＣａＢＰ—　

Ｄ２８ｋ的表达，且与蛋壳的形成有关　。　

畜禽业中蛋鸡的蛋壳质量和肉鸡腿病等问题备　

受业界和学术界的关注。研究禽类蛋壳形成过程中　

ＣａＢＰ—Ｄ２８ｋ与钙吸收利用的关系及其调控作用，　

真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的构建及其在体内外细胞中的表

真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的构建及其在体内外细胞中的表

中国实验诊断学２０１１年１月　第１５卷箜　塑　

文章编号：１００７—４２８７（２０１１）０１—００１１—０４　

真核表达质粒ＰｅＤＮＡ３．１（＋）一带有白蛋白信号肽　

的Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ（１２０—１８０ａａ）的构　建及其在体内外　

细胞中的表达　

刘建巨　，关继奎　，王琳　，赵秀梅　，郑建秋　，李丹　，闫庆慧　

（１．哈尔滨医科大学第一临床医学院眼科医院，黑龙江哈尔滨１５０００１；２．大庆油田总医院）　

摘要：目的构建真核表达质粒ＰｃＤＮＡ３．１（＋）一带有白蛋白信号肽的Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ（１２０—１８０ａａ）并了解其在体内外真核　

细胞中的表达。方法将带有白蛋白信号肽的Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ（１２０－１８０ａａ）的逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）产物克隆至　

ｐｃＤＮＡ３．１（＋）真核表达载体上，经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后，以脂质体介导法转染体外培养的真核２９３Ｔ　

细胞及注射人鼠骨骼肌细胞中，了解其在体内外真核细胞中的表达情况。结果　我们获取了包含带有白蛋白信号肽　

的Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ（１２０—１８０ａａ）成熟肽及ＨＡ抗原在内的一段ｃＤＮＡ片段，并成功地与真核表达载体ＰｃＤＮＡ３．１（＋）连接，经测　

序表明，其中含有的带有白蛋白信号肽的Ｖａｓｏｓｔａｆｉｎ（１２０—１８０ａａ）成熟肽的序列与Ｇｅｎｅｂａｎｋ上报道的序列完全一致。即　

我们成功构建了真核表达质粒ＰｃＤＮＡ３．１（＋）一带有白蛋白信号肽的Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ（１２０。１８０ａａ）。之后，在转染了该质粒的体　外真核２９３Ｔ细胞的上清液中及骨骼肌注射了该质粒的鼠血液中，利用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测到了目的基因的蛋白质。结　

论带有白蛋白信号肽的真核表达质粒ＰｃＤＮＡ３．１（＋）一Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ（１２０—１８０ａａ）增强了蛋白分泌表达能力，这为进一步应　

用该质粒治疗全身新生血管类病奠定了一定基础．　

关键词：Ｖａｓｏｓｔａｆｉｎ（１２０－１８０ａａ）；２９３Ｔ细胞；基因克隆；真核表达　

人Smurf1 shRNA真核表达载体的构建与鉴定

人Smurf1 shRNA真核表达载体的构建与鉴定

第３５卷　第５期　２０１０年１０月　贵　阳　医　学　院　学报　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＧＵＩＹＡＮＧ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＣＯＬＬＥＧＥ　ＶＯ１．３５　Ｎｏ．５　２０１０．１０　

人ＳｍｕＫ１　ｓｈＲＮＡ真核表达载体的构建与鉴定　

董　红　，卢思广ｈ，冯　霞　（１．徐州医学院附属连云港医院，江苏连云港２２２００２；２．赣榆县人民医院，江苏赣榆２２２１００）　

［摘　要］目的：构建三条人Ｓｍｕｒｆｌ　ｓｈＲＮＡ真核表达载体，以逆转ＴＧＦ一［３１诱导人ＨＫ．２细胞转分化。方法：　针对人Ｓｍｕｒｆｌ基因设计，采用体外转录生物合成的特异性短发夹ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）双链分子，对重组质粒（命名为　ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ—ＳＩ　ｓｈＲＮＡ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ—ｓ２　ｓｈＲＮＡ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ—Ｓ３　ｓｈＲＮＡ）进行１％琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定及测序鉴定。　结果：１％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定证实Ｓｍｕｒｆｌ　ｓｉＲＮＡ表达载体克隆构建成功，插入序列测序结果与合成序列　结果一致。结论：Ｓｍｕｆｆｌ　ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ．Ｓ１　ｓｈＲＮＡ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ—ｓ２　ｓｈＲＮＡ、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ—ｓ３　ｓｈＲＮＡ真核表达载体构建成功。　［关键词］ＲＮＡ干扰；质粒；真核细胞　［中图分类号］Ｒ３４２．２　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１０００．２７０７（２０１０）０５４）４９６－０５　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｍｕｒｆｌ　ｓｈＲＮＡ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ＤＯＮＧ　Ｈｏｎｇ　，ＬＵ　Ｓｉｇｕａｎｇ　，ＦＥＮＧ　Ｘｉａ。　（Ｊ．Ｔｈｅ　Ａｆｆｉｌｉｃｔｅｄ　Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｘｕｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ　２２２００２，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；　２．Ｐｅｏｐｌｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＧａｎｙｕ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｇａｎｙｕ　２２２１００，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｒｅｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｓｍｕｒｆｌ　ｓｈＲＮＡ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓ－　ｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｒｅｔｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ・１３　１一ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＨＫ－２　ｃｅｌｌｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）ｗｈｉｃｈ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉａｌｌｙ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｒｅｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＴＡＣＧＴＣ—　ＣＧＧＴＦＧＴＡＴＧＴＡＡ，ＴＧＡＡＧＧＡＡＣＧＧＴＧＴＡＴＧＡＡ，ａｎｄ　ＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＡＴＴＣＧＡＡＧＴ）ｏｆ　Ｓｍｕｒｆｌ，　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ（ｎａｍｅｄ　ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ—Ｓ１，ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ—Ｓ２，ａｎｄ　ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ－　Ｓ３）ｗｅｒｅ　ｆｉｎａｌｌｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｓｍｕｒｆｌ　ｓｉＲ－　ＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｓｉＲＮＡ　０ｌｉｇｏｎｕｃｌｅ０ｔｉｄｅｓ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：Ｓｍｕｒｆｌ　ｓｉＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｃｏｎ—　ｓｔｒｕｃｔｅｄ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｃｅ；ｐｌａｓｍｉｄｓ；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ