医学免疫学- 免疫学检测技术共31页

免疫学检测技术的原理分 析免疫学教材课件
免疫学检测技术在疾病诊断、治疗及药物研发中具有广泛应用。本课件将介 绍其工作原理和应用，以及其优势和限制，以及如何使用本教材。
免疫学检测技术的概述
免疫学检测技术是应用于检测体液和细胞中抗原-抗体反应的技术。它们允许对诊断、预防和治疗疾病的免疫反应进 行研究。
免疫免疫性技术的应用
免疫免疫性技术利用T细胞和B细胞等免疫细胞的高度特异性来检测和研究有关免疫系统的复杂反应。
1
应用
流式细胞术，蛋白质微阵列。
2
蛋白质微阵列
是一种新型的免疫学技术，可快速，同时检测大量蛋白质。通过识别特定的抗体-抗原结合，可以确 定已标记的分子的存在和浓度。
3
流式细胞术
用于确定特定细胞的表面蛋白和内部细胞因子，并可用于诊断疾病。
工作原理
检测抗原或抗体的存在或活性，以确定某种疾病的 存在或发展过程中的免疫反应。
分类
免疫法理方法和免疫免疫性方法，包括酶免疫分析、 放射免疫分析和荧光免疫分析等。
应用
用于检测病毒、细菌、真菌和其他微生物感染，肿 瘤标志物，自身免疫疾病和输血等。
优势和限制
高度灵敏，可靠和快速，但也可能造成假阴性和假 阳性结果。
荧光免疫分析(FLISA)的优势和应用
FLISA是一种荧光标记免疫检测技术，其应用广泛且灵敏 。与ELISA类似，FLISA利用二抗或标记抗体检测抗原或抗体 的存在和浓度。
优势
灵敏和高度特异性；快速且易于自动化，具有高通量。
应用
FLISA用于检测肿瘤标志物、细菌、病毒和各种生物分 子的存在和浓度。
酶免疫分析(ELISAቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的原理和优势
ELISA是一种常用的免疫学检测技术，其工作原理是通过将抗原-抗体体系与标记酶和底物反应，从而检测 抗原或抗体的存在或浓度。

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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
Байду номын сангаас
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
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医学免疫学- 免疫学检测技术
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿

各实验室操作不规范，质量难以保证。有学者认为ELISA 技术已逐步走向退化，可能会逐步退出临床实验室。
• 化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初，是一种新
型标记免疫测定技术
• 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其机
制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化
学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升
• 标记物及其类别 • 常见三大免疫标记检测原理
• 随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学
理论的建立，使大量免疫学检测技术被不 断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用 中也不断地推陈出新。目前应用免疫学原 理检测的检验项目占到三级综合医院检验 科全部检验项目的1／4，医疗收入约占1／
• 三大常使用标记物质
土元素，需要外在的稳定光源照射，光的波长产生stoke位移，并
有一个时间滞后以化便学于发检光测波长改变后的光子时数间量分。辩荧光
标记物 酶-发光底物、发光剂
稀土离子，如铕
稳定性
稳定性非常好
影响被标记物的生物活性与免 疫活性
灵敏度
灵敏
稍高于化学发光
反应体系
接近中性
酸性，易引起蛋白质变性
包被技术
不透明微量孔壁吸附, 提高分析灵敏度,降低
大
• 标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费 • 操作步骤很难自动化 • 反应时间长，出报告时间长
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，加入酶
标抗原或抗体、酶反应的底物后，底物被酶催化 变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或 定量分析
1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种 非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了 广泛应用。 缺点 ➢试剂制备困难 ➢操作步骤复杂，耗时长 ➢影响因素多，质量控制难以保证 ➢最后测定的是颜色的光密度，其精密度、敏感性、可检测范围远不 如发光免疫技术

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一、凝聚反应(Agglutination)
二、沉淀反应
1、溶液中的沉淀反应
2、凝胶扩散沉淀
3、免疫电泳Biblioteka 血清免疫电泳火箭电泳
对流免疫电泳
三、补体参与的反应
四、免疫标记的抗原抗体技术
酶联免疫吸附（ELISA）
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一、凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合 反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整 的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在 一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称 为凝集原，抗体称为凝集素。
. Equivalence – Lattice formatio6 n
抗原或抗体检测原理
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7
• 免疫学（Immunology）：
是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应 答的规律及免疫应答的调节的一门科学。
• 免疫的定义（Immunity）：免疫是机体识 别自我与非自我的过程。排除异己，维护 自身稳定的生理反应。
体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使
细胞发生癌变，形成肿瘤等，机体可识别、清除这些
细胞，这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下
或失调时，会导致肿瘤或癌. 症。
9
抗原 （Antigen）
抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，
并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生 反应的物质。
亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。
自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体 蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白
2. 大分子胶体：一般在10 kD以上 。
3. 具有复杂的立体结构或空间构象.
如明胶分子量虽然为100 kD，但结构简单，免疫原性差。

免疫荧光技术（IFT）
原理：利用荧 光标记的抗体 与抗原结合， 通过荧光显微 镜观察荧光信
号
应用：检测细 胞表面抗原、 细胞内抗原、
细胞因子等
优点：灵敏度 高、特异性强、
可定量分析
缺点：操作复 杂、成本较高、 需要专业设备
免疫沉淀技术（IP）
原理：利用抗原-抗体特异性结 合，沉淀出目标蛋白
应用：蛋白质相互作用研究、 蛋白质组学研究等
细胞因子 检测：用 于诊断免 疫系统疾 病、肿瘤 等
免疫组化 检测：用 于诊断肿 瘤、感染 性疾病等
流式细胞 术：用于 检测免疫 细胞亚群、 细胞因子 等
免疫荧光 检测：用 于检测抗 原、抗体 等
免疫印迹 法：用于 检测蛋白 质、抗体 等
在生物制品检测中的应用
疫苗检测：检 测疫苗的有效
性和安全性
抗体检测：检 测抗体的浓度
检测方法：开发新 型检测方法，提高 检测灵敏度和准确 性
自动化：实现检测 过程的自动化，提 高检测效率
便携化：开发便携 式检测设备，方便 现场检测和快速诊 断
THANKS
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例
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Part Two
免疫学检测技术概 述
免疫学检测技术的定义和分类
免疫学检测技术的发展历程
19世纪末，免疫 学检测技术开始 萌芽
20世纪初，免疫 学检测技术逐渐 成熟
20世纪中叶，免 疫学检测技术快 速发展
21世纪初，免疫 学检测技术进入 分子水平
免疫学检测技术的应用领域
优点：灵敏度高、特异性强、 操作简便
注意事项：选择合适的抗体、 控制反应条件、避免非特异性 结合等
流式细胞术（FC）

荧光免疫检测技术(FI)的基本原理
荧光免疫检测技术与FIA类似，但是不需要标记酶和底物，而是直接标记荧光染料，通过检测荧光信号 随时间变化的曲线来判断样品中免疫分子的存在和浓度。
无需酶标记
荧光免疫检测不需要使用 酶标记荧光素酶，避免了 潜在的酶和底物污染。
高通量检测
荧光免疫检测可以在低浓 度下完成快速检测，适用 于高通量和大规模的样品，可以 标记多种不同的免疫分子， 提高检测的多元性和特异 性。
放射免疫检测技术(RIA)的基本原理
放射免疫检测技术利用放射性标记的免疫分子来检测样品中目标免疫分子的存在和浓度。
1
放射性标记
将免疫分子与放射性元素标记如131I、125I等结合。
2
孵育和分离
将标记的免疫分子与待测样品反应孵育，通过分离获得实验的反应产物。
免疫学检测技术基本原理
免疫学检测技术是一种检测生物体内免疫分子的方法，应用广泛于临床诊断、 生命科学、农业、环境监测和食品安全等领域。
免疫学检测技术的定义和概述
免疫分子的来源
免疫分子包括抗体、补体和细 胞因子等，都是免疫系统特异 性抗原识别和应对的产物。
检测方法的基本原理
通过与特定抗原或抗体结合来 检测样品中目标免疫分子的存 在和浓度。
免疫学检测技术的应用
广泛应用于疾病诊断、药物开 发、生物学研究和疫苗制备等 领域，成为现代生物技术发展 的重要手段。
免疫学检测技术的常见方法
直接法
直接使用标记的抗体或抗原检测样品中的免 疫分子。
间接法
利用未标记的抗体与样品中的免疫分子结合， 再使用标记的二抗或蛋白A/G结合物检测。
竞争法
利用抗原或抗体与样品中的免疫分子竞争结 合，测定中目标免疫分子的含量。

• 体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。 OT-PPD皮试
一、T细胞功能的检测
➢T细胞增殖试验 ➢T细胞分泌功能测定 ➢T细胞介导的细胞毒试验 ➢体内试验
（一）T淋巴细胞增殖试验
1. 原理：
•淋巴细胞
•刺激物
•DNA合成
•分化
•母细胞
•细胞变大 •细胞浆扩大 •空泡 •核仁明显 •核染色质疏松
• 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：
•+
•病人的RBC •体内anti-Rh
•+
•由于抗体多属于IgG，分子 量较小，抗体与红细胞间的 结合力不能克服细胞间的排 斥力，不出现凝集
•体外加 入抗人
IgG
•出现凝集现象， 叫直接库姆试验
•+
•正常人O型血 的Rh+的RBC
•患者血清内 的游离anti-Rh
第二节 检测抗原或抗体的体外试验
• 凝集反应 • 沉淀反应（中和反应） • 免疫标记技术：用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应 • 蛋白质芯片技术
一、凝集反应 (Agglutination)
• 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结 合、凝集的现象。
• 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗 体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集 现象。又分为玻片法（定性试验）和试管 法（半定量试验）。
负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。 3. 该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。
• ⑥免疫印迹法-Western blotting
免疫印迹法（Immunoblotting）
• 将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区 的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免 疫等技术测定。

46
h
46
胶体金结合物
h
47
固相NC膜
h
48
DICA 试剂条
样
结
品
合
NC
垫
物
膜
吸 水 垫
垫
h
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DICA——双抗体夹心法测抗原
样
结
品
合
NC
垫
物
膜
吸 水 垫
垫
h
50
试验方法
免疫层析试验以双抗体夹心法为例。
h
51
LATERAL FLOW TEST STRIP OF VEDALAB
30
h
52
（六）免疫印免迹疫技印术迹—试—验Westernblot
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（二）荧光免疫技术
荧光物质：
荧光物质是一类经激发能发射荧光的 物质。
荧光色素： 能产生明显荧光并可用作 染料的有机化合物
h
34
常用荧光色素
1. 荧光色素：FITC、RB200、PE等
h
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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RB200
FITC
h
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荧光抗体技术类型
1、直接法
荧光素标记抗体
抗原
F
F
h
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F
2、间接法
抗原
h
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常用免疫标记技术
放射免疫技术 荧光免疫技术 酶免疫技术 胶体金免疫技术 化学发光免疫技术 生物素-亲和素免疫技术
h
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（一）酶免疫技术
基本原理： 酶免疫技术是利用酶标记抗体(抗原) 与相
应抗原(抗体)反应形成抗原-抗体-酶复合 物，酶催化相应的底物显色，根据颜色变 化和显色深浅进行定性和定量。

六、免疫相关基因分析
*包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑 点杂交、原位杂交等以及PCR技术等。
杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用 放射性核素或其他标记物(生物素、荧光素、 地高辛等)标记，并与目的基因互补的DNA片 段或单链DNA、RNA。分为cDNA探针、寡核 苷酸探针、基因组DNA探针及RNA探针等。
(五)细胞内细胞因子的检测 采用FCM免疫荧光技术可从单细胞水
平检测不同细胞亚群中的细胞因子,用两 种标记的荧光抗体可在一种细胞内同时 测定两种不同的细胞因子。
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细胞因子受体检测的基本技术
细胞因子的广泛生物学活性是通过与 各自相应的受体结合而发挥的。因此细 胞因子受体的检测与细胞因子检测一样， 已成为基础理论和临床免疫学研究的一 个重要内容。
*常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺 入法、比色法、染色法和直接计数法等。其中 测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括 MTT、XTT、MTS和NAG等方法。
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2. 细胞毒活性测定法 许多细胞因子(TNF)针对转化的细
7. 细胞因子mRNA表达的测定还可采用 RT-PCR、原位杂交与原位PCR,RNA半寿期 的检测,进行中的转录分析等。
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(二)BCR及TCR克隆性基因重排分析
1．Southern印迹杂交法：仅适用于科研， 而不适用于临床诊断。
趋 化 性 (chemotaxis) 是 指 诱 导 细 胞 向 趋 化 因子化学浓度高的方向作定向移动,可采用琼 脂糖和微孔小室趋化试验测定细胞因子的趋 化活性；

T细胞在体外受到刺激物作用下，细胞代谢和形态相继 发生变化，从而产生一系列增殖的变化，细胞变大，浆扩大， 出现空泡、核仁明显，染色质疏松→转化为淋巴母细胞。计 数200个淋巴细胞，算转化率。
细胞免疫的体外检测
•大、小吞噬细胞 •大吞噬细胞－单核巨噬细胞 •小吞噬细胞－中性粒细胞
血涂片大吞噬细胞
大吞噬细胞吞噬实验（示教）
※ 观察示教，并作图
巨噬细胞吞噬作用
2、淋巴细胞的测定
（一）T细胞总数及亚群的测定 （二）T细胞功能的测定
1.淋巴细胞增殖试验 形态学方法、3H-TdR掺入法等。
2.细胞毒试验 3.细胞因子测定
T
+
T
T T
1）T细胞花环形成试验 T细胞表面有绵羊红细胞受体，形成花环。
计数200个淋巴细胞，结合3个SRBC或以上者的E 花环 阳性细胞数。
玫瑰花环试验
E-rosette formation test
正常范围：50%-80%
2. T细胞增殖试验（淋巴细胞转化试验）
医学免疫学实验
细胞免疫的体外检测
1.小吞噬细胞的吞噬作用（操作） 2.E-花环试验、淋巴细胞转化试验、大、
小吞噬细胞的吞噬现象（示教）
小吞噬细胞的吞噬作用
1. 抽取2ml血到抗凝管 2. 加入等量菌液，混匀 3. 37ºC反应30min 4. 加1小滴推片（制作血涂片） 5. 自然干燥 6. 加瑞氏染液以及等量蒸馏水反应10sec 7. 细水流冲洗 8. 吸干后油镜检查