抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性的测定(精)

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。

此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。

因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。

2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。

反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。

每个处理设3 个重复。

（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。

用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。

取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。

植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定作者:《果蔬贮藏加工学实来源:华南农大浏览数:2949 录入:2007-6-16 14:53:40 验指导》植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定一、原理抗坏血酸氧化酶能利用空气中的氧氧化抗坏血酸成为脱氢抗坏血酸；多酚氧化酶可催化空气中的氧氧化多酚，成为相应的醌，形成的醌能被抗坏血酸还原。

因此，在酶提取液中加入抗坏血酸，可测定抗坏血酸氧化酶的活性，加入抗坏血酸及焦儿茶酚，可测定抗坏血酸及多酚氧化酶两者的活性，相减即可求出多酚氧化酶的活性。

抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸。

碘酸钾在酸性条件下与碘化钾反应放出碘，放出的碘与抗坏血酸作用，将之氧化成脱氢抗坏血酸，多余的碘能使淀粉变为蓝色。

二、材料与设备材料：马铃薯块茎设备：水浴锅、台秤、离心机试剂：pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液、0.1％抗坏血酸、0.02mol/L焦儿茶酚、10％三氯乙酸、1％淀粉。

0.05mol/L碘液：碘化钾2.5g溶于200ml蒸馏水，加冰醋酸1ml，再加0.1mol/L碘酸钾12.5ml，定容至250ml。

三、试验步骤（一）酶液制备：称取马铃薯块茎10.0g，用预冷pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液，研磨匀浆，定容至50ml，在18-20℃水浴浸提30分钟，中间摇动数次，再于3000×g离心10分钟，取上清液，4℃保存备用。

（二）酶活性测定：１. 取6个三角瓶(50-100ml)，标上号码，分别加入下列试剂(ml)：┌──┬────┬───────┬─────────┬──┬─────┐│瓶号│ 蒸馏水│0.1％抗坏血酸│0.02mol/L焦儿茶酚│ 酶│煮5分钟酶│├──┼────┼───────┼─────────┼──┼─────┤│ 1 │ 4 │ 2 │ │ 2 │ ││ 1' │ 4 │ 2 │ │ 2 │ ││ 2 │ 4 │ 2 │ │ │ 2 ││ 3 │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │ ││ 3' │ 3 │ 2 │ 1 │ 2 │ ││ 4 │ 3 │ 2 │ 1 │ │ 2 │└──┴────┴───────┴─────────┴──┴─────┘1、3瓶各作一次重复，2、4瓶作空白将6个三角瓶放入18-20℃水浴反应5分钟,立即分别加入10％三氯乙酸1ml，摇匀，终止酶反应。

朴东日：多酚氧化酶活性的测定。

一、试验目的本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原理及操作技术。

二、试验原理酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。

本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。

三、试验材料、试剂及试验用品材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯处理。

药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）四、实验方法：1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。

2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。

将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。

以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。

3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。

(注意空白为：2.5 mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。

4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V (式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。

多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。

多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。

二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。

由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。

把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。

精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。

用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。

由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min 内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。

所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。

研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。

四、试剂1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。

贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。

2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。

3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。

其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。

测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。

以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。

1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。

（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。

（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。

（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。

（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。

1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。

（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。

（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。

（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。

多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定方法（一）试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。

2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。

3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。

4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。

贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。

贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升）5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）方法：1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。

在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。

2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。

然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。

最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。

多酚氧化酶的测定方法
多酚氧化酶的测定方法有多种，常用的方法包括:
1. 分光光度法：利用多酚氧化酶催化产生的还原型多酚吸收UV-Vis光谱上的特征波长，通过测定吸光度确定多酚氧化酶活性。

2. 荧光法：利用多酚氧化酶催化荧光染料的氧化还原反应，测定荧光信号的变化，从而确定多酚氧化酶活性。

3. 比色法：利用多酚氧化酶催化产生的还原型多酚与某些化学试剂发生比色反应，从而测定多酚氧化酶活性。

4. 滴定法：利用多酚氧化酶对还原性物质的氧化作用，滴定一定浓度KMnO4确定多酚氧化酶的活性。

5. 原位测定法：利用电化学方法实时监测多酚氧化酶产生的还原型多酚浓度变化，从而确定多酚氧化酶的活性。

实验四、多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种广泛存在于植物、菌类和动物体内的酶，主要催化化学反应为将多酚氧化成醛或酮。

本实验旨在通过测定PPO的活性来了解酶的基本特性及其酶学性质。

一、实验材料1、经过离心沉淀的香蕉、苹果、洋葱原汁。

2、6%聚乙烯醇（PVA）溶液。

3、明胶溶液（1%）。

4、酚酞指示剂。

5、75mM bicine缓冲液（pH 8.5）。

6、0.05% 过氧化氢溶液。

7、1% 多巴胺溶液。

8、分光光度计。

二、实验原理多酚氧化酶是一种铜单子酶，催化剂的过程时首先将基质中的酚乙酸类化合物与氧气反应形成间醌，然后间醌的氧化、聚合，形成花青素、黑色素等产物。

本实验采用的基质是多巴胺（L-dopa），媒介是酚酞指示剂，测定体系的光学吸收度。

酶的活性按单位时间内反应的基质质量而计算。

三、实验步骤1、提取PPO将香蕉、苹果、洋葱各取50g，切碎，加入200ml 0.1M盐酸溶液，搅拌后放在4℃冷库20-30min，滤去上清液。

将残渣加入100ml冷水，搅拌，离心至沉淀物无明显色泽，取上清液后pH调节至8.5，保存于冷库。

2、测定PPO的活性（1）制备基质溶液：10mg多巴胺溶于2ml 0.1M的硫酸钠溶液中，用1M的NaOH溶液调节pH至8.5，加入12ml0.75M缓冲液，加水至50ml。

（2）制备酚酞指示剂溶液：2mg的酚酞溶于100ml的乙醇中，加水至1L，制成0.2%的酚酞溶液。

（3）测定反应系统：将基质溶液、酚酞指示剂溶液和一定量提取液混合，在25℃下恒温反应5min。

（4）实验对照：在上述条件下，仅加入基质溶液和酚酞指示剂溶液，无提取液作为实验对照。

（5）催化反应停止：加入0.5ml 的聚乙烯醇溶液。

（6）光度计测量：在650nm处上述反应体系产生的色素的吸光度。

4、结果计算将吸收度计算为1cm光程曲线的峰高比，用表格法计算多酚氧化酶活性反应速率以μmol/min为单位。

多酚氧化酶活性的测定多酚氧化酶(POD)是一种酶类，广泛存在于植物、细菌和真菌等生物体中，具有氧化多酚的功能，可将多酚类物质氧化为其对应的醛酮或烯醇。

多酚氧化酶活性的测定是研究植物生理生态、农业及食品科学等领域的重要技术手段之一。

多酚氧化酶活性的测定方法有多种，常见的测定方法有单宁酸、苯胺、硫脲、芳香胺等底物的光度法、荧光法、色谱法和电化学法等。

其中，光度法测定多酚氧化酶活性是相对最简便、经济、有效的方法之一。

一、实验原理多酚氧化酶活性的测定原理基于多酚类物质的氧化反应，其反应方程式如下：多酚+ H2O2 → 多酚氧化酶→ 合成物 + H2O在光度法中，用苯酚为底物，通过苯酚酸化后生成背景吸光度，再将多酚加到反应体系中，多酚在酸性条件下与过氧化氢发生氧化反应，产生黄色的产物苯醛，可在310nm处检测吸光度增加。

二、实验步骤步骤一：制备反应液(1)苯酚称取1g苯酚溶于50ml0.1mol/L的钠碳酸中，加入2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至显红色终点，记录滴定体积，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定至淡粉色的时间，同时记录滴定体积，测定得到苯酚的浓度。

(2)过氧化氢称取30%的过氧化氢溶液，在室温下稀释成0.04%过氧化氢溶液。

(3)缓冲液将0.2mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液(PH 6.0)浓度稀释成0.05mol/L。

(4)酶提取液在质量浓度等于1的0.05mol/L的柠檬酸-磷酸缓冲液中先加入1mmol/L的PEG6000，频繁将其混合均匀之后，再加入5%聚乙烯醇，在最后再加入一些几丁糖粉，并不断地搅拌混合均匀之后过滤清除残留物，提取所需酶液。

(1)标准液分别取0-40μmol/L的马尾松酚，加入0.1mol/L的硫酸调节pH至1，在0.1mol/L的缓冲液溶液中进行100μl反应，80℃下控制反应时间在5min在323nm检测吸光度，绘制标准曲线。

(2)样品处理将植物或细胞样品在工作台上用0.1mol/L的N/2 H2SO4溶解，然后过滤，用样品液稀释1倍。

实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。

二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。

用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。

反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋ H2O三、材料、仪器及试剂1. 材料：马铃薯块茎等2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚；20％三氯乙酸。

四、实验步骤1. 粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。

将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2. 活性酶的测定在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。

五、酶活性的计算以每min内A值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。

525A 酶提取液总量（ml）酶活力（·min－1）＝———————×———————————0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）A 酶提取液总量（ml）酶的比活性(·g－1Fw·min)=————————×——————————0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。

货号：MS1303 规格：100管/96样抗坏血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性测定试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。

细胞壁内的抗坏血酸和AAO 与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。

AAO氧化AsA所形成的MDHA可通过质膜上的细胞色素b 还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。

测定原理：AAO可直接氧化AsA，通过测定AsA的氧化量，可计算得AAO活力。

实验中所需仪器及设备：低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV 板）、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。

试剂组成和配制：试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。

临用前加入2mL蒸馏水充分溶解。

粗酶液提取：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。

16000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

AAO 测定操作：1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到265 nm。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、170μL预热的试剂二和10μL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收A1和A2，△A =A1-A2。

AAO 活性计算公式：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1). 按蛋白浓度计算AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol AsA为1个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T= 92.4×△A÷Cpr(2). 按样本质量计算AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1nmol AsA 为1个酶活单位。

一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶•普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与02氧化形成醌，使组织形成褐变.以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410 nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的0D值产生变化，通过0D值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2O2 -------------------------------- 邻醌+ H2O三、试验材料、试剂及试验用品1. 材料：马铃薯块茎。

2. 仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3 .试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L 邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L 磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA ）；10mmol/L 亚硫酸钠四、实验方法：1•多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在4C下离心（8000r/min）5min,取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

食品中氧化酶活性检测方法的比较与应用研究随着人们对食品安全和食品质量的不断关注，食品中氧化酶活性的检测方法逐渐成为了重要的研究方向。

氧化酶在食品中的高活性可能导致食品的品质下降、变质甚至对人体健康造成危害。

因此，准确测定氧化酶活性对于食品质量控制和食品安全具有重要意义。

在食品中，常见的氧化酶包括过氧化氢酶、多酚氧化酶和抗坏血酸氧化酶等。

这些氧化酶在食品生产和加工过程中，特别是在果蔬加工和果汁饮料生产中起着重要作用。

然而，高活性的氧化酶容易导致食品的品质下降，例如在果汁中引起褐变和味道的变化。

因此，准确测定氧化酶活性对于保证食品的品质具有重要意义。

目前，常用的食品中氧化酶活性检测方法主要包括光度法、电位差法、荧光法和电化学法等。

这些方法各有优缺点，适用于不同类型的食品样品，并在食品质量监控和研究中得到了广泛应用。

在光度法中，常用的方法包括酶促反应的速率测定和底物消耗的测定。

速率测定通常通过测量酶促反应体系中产生的产物或底物的浓度变化来反映酶的活性。

光度法简单、快速，但缺点是无法对复杂微量物质进行测定，且易受样品成分和干扰因素的影响。

电位差法是测定酶活性的一种常用方法，它通过测量酶催化反应过程中产生的电位差变化来评估酶的活性。

这种方法适用于测定具有电化学反应的酶活性，如过氧化氢酶和蔗糖酶。

电位差法准确度高，但操作复杂、耗时较长，并且对仪器设备要求较高。

荧光法是一种敏感且快速的检测方法。

通过在酶促反应中引入荧光染料，如二苯丙酮，通过测量荧光强度的变化来评估酶的活性。

荧光法适用于大多数氧化酶的测定，并且具有很高的选择性和灵敏度。

然而，荧光法对实验条件和仪器设备要求较高，且对荧光物质的稳定性有一定要求。

电化学法是一种常见的氧化酶活性检测方法，它通过测量酶催化反应中所产生的电流或电位来评估酶的活性。

电化学法具有灵敏度高、快速、准确度高的特点，并且适用于多种氧化酶的测定。

但是，电化学法对实验条件和仪器设备的要求较高，且需要一定的操作经验和技术。

植物呼吸酶的测定植物体内的呼吸酶，是催化植物在呼吸过程中，进行氧化还原的一些酶类。

植物体内的末端氧化酶是将从基质传递来的电子，直接交给氧并产生H2O或H2O2。

植物体内的末端氧化酶有抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等。

这个复杂的氧化酶系统，有助于植物对不良外界环境条件的适应。

通过本实验，掌握一个简便快速测定抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的方法---滴定法测定抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性。

一、原理1. 抗坏血酸氧化酶活性的测定抗坏血酸在抗坏血酸氧化酶的作用下，可以氧化为脱氢抗坏血酸。

以抗坏血酸为底物，加入酶的提取液，酶与底物充分反应，此时抗坏血酸氧化酶将抗坏血酸消耗掉一部分，根据消耗的多少来计算酶的活性。

抗坏血酸消耗的多，说明酶的活性强。

抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。

I2的产生：KIO3 + 5KI + 6HPO3→ 3I2 + 6KPO3 + 3H2O用碘液滴定剩余的抗坏血酸：2. 多酚氧化酶活性的测定多酚氧化酶在有氧存在的条件下，可以将酚氧化成醌，其反应如下：邻醌再与抗坏血酸作用，将它氧化成脱氢抗坏血酸。

上述反应，由于醌类物质的氧化还原电位比抗坏血酸的高（邻醌△ E=0.696 ，抗坏血酸△ E=0.166 ）。

所以邻醌能夺取抗坏血酸上的氢，生成邻苯二酚。

因此，多酚氧化活性的测定，参加反应的底物有两种：即邻苯二酚和抗坏血酸。

多酚氧化酶的活性，也用抗坏血酸的消耗量求得。

二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料：马铃薯芽（二）试剂1 ． pH 6.0 的磷酸盐缓冲液： A 液为 1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液， B 液为 1/15 mol/L 磷酸二氢钾溶液，取 A 液 10 mL 与 B 液 90 mL 混均即可。

2 ． 0.1 ％抗坏血酸，试验当天配制。

3 ． 0.02 mol/L 焦儿茶酚（邻苯二酚）：称取 0.22 g 焦儿茶酚溶于 100 mL 水中 , 试验当天配制。

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。