紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法
一、实验目的
1．了解紫外可见分光光度法的基本原理
2．了解紫外可见分光光度计的结构、性能及使用方法
3．熟悉定性分析的方法
二、实验原理、方法和手段
（一）实验原理
紫外分光光度法，又称紫外吸收光谱法，它是研究分子吸收190.0~1100.0nm 波长范围内的吸收光谱。

紫外吸收光谱主要产生于分子价电子在电子能级间的跃迁，是研究物质电子光谱的分析方法。

通过测定分子对紫外光的吸收，可以对大量的无机物和有机物进行定性和定量测定。

其是有机分析中一种常用的方法，具有仪器设备简单、操作方便、灵敏度高的特点，已广泛应用于有机化合物的定性、定量和结构鉴定。

由于紫外吸收光谱的吸收峰通常很宽，峰的数目也很少，因此在结构分析方面不具有十分专一性。

通常是根据最大吸收峰的位置及强度判断其共轭体系的类型及在结构相似的情况下，区分共轭方式不同的异构体。

1．化合物中微量杂质检查
利用紫外光谱法可以方便地检查出某些化合物中的微量杂质。

例如，在环己烷中含有微量杂质苯，由于苯有一B吸收带，吸收波长在220～270nm范围，而环己烷在此处无明显吸收峰。

因此，根据在220～270 nm处有苯的粗细结构吸收带，即可判断环己烷中是否有微量杂质苯存在。

2．未知样品的鉴定
用紫外光谱法鉴定未知样品时，若有标准样品，则把试样和标准样品用相同的溶剂，配制成相同浓度的溶液，分别测量吸收光谱，如果两者为同一化合物，则吸收光谱应完全一致。

若无标准样品，可与文献上的标准谱图进行比较。

3．定量分析
应用紫外光谱法进行定量分析的方法很多，如：a. 标准曲线法、b. 对照法、c. 吸光系数法、d. 混和物的定量、e. 双波长分光光度法。

但最常用最简单的方法就是“标准曲线法”。

4．有机化合物分子结构的推断
（1）共轭体系的确定
通过测定有机化合物的紫外光谱，可以确定分子中有无共轭体系及共轭的程度。

如果一种化合物在210nm以上无吸收，可以认为不含共轭体系。

在210～250nm区域有较强吸收带，则可能有两个共轭双键。

（2）互变异构体的判别
某些有机化合物在溶液中存在互变异构体，利用它们紫外吸收光谱的特点，
可以进行判别。

例如，乙酰乙酸乙酯存在酮式和烯醇式两种异构体。

酮式异构体孤立羰基，不存在共轭体系，在近紫外区无强的吸收，只是在吸收波长272nm （εmax=16）处有弱吸收，由n→π*跃迁引起；烯醇式异构体具有共轭体系，故在近紫外有较强的吸收，吸收峰波长在243纳为（εmax=16.000）。

（3）顺反异构体的判别
当有机化合物分子空间构型不同时，其紫外吸收光谱也不一样。

通常反式异构体的吸收峰波长比顺式异构体的吸收峰波长要长，吸收强度要大。

利用这种判别，可以鉴别顺反异构体。

例如：1，2-二苯乙烯的顺反两种异构体λmax和εmax不一样。

（4）样品浓度与溶剂的选择
紫外光谱法所测定的样品通常是液态物质。

由于吸光度和浓度之间的线性关系，即朗伯-比耳定律（A=εbc），只有在稀溶液下才成立。

所以，对待测物质的浓度就要有所要求，一般用量：1cm池子，约3ml溶液，样品量0.1~100mg。

另外，由于溶剂效应，即某些物质的紫外吸收光谱特性，与所采用溶剂的极性有密切的关系，溶剂的极性不同，同一化合物的紫外吸收光谱形状、吸收峰位置不一样。

在测试前，要正确选择溶剂。

即记录吸收波长时，应注明所用溶剂，在把一种未知物的吸收光谱与已知化合物吸收光谱进行比较时，要使用相同溶剂。

溶剂除了对吸收波长有影响外，还影响吸收强度和精细结构。

例如B吸收带的精细结构在非极性溶剂中较清楚，但在极性溶剂中则较弱，有时消失而出现一个宽峰。

苯酚的B吸收带就是这样一个例子。

苯酚的精细结构在非极性溶剂庚烷中清晰可见，而在极性溶剂乙醇中则完全消失而呈现一宽峰。

因此，在溶解度允许范围内，应选择极性较小的溶剂。

另外，溶剂本身有一定的吸收带，如果和溶质的吸收带有重叠，将妨碍溶质吸收带的观察。

（二）紫外分光光度计的构造原理
图2-1 双光路紫外—可见分光光度计光程原理图
由光源（钨丝灯或氘灯，根据波长而变换使用）发出的光经入口狭缝及反射镜反射至石英棱镜或光栅，色散后经过出口狭缝而得到所需波长的单色光束。

然后由反射镜反射至由马达转动的调制板及扇形镜上。

当调制板以一定转速旋转时，时而使光束通过，时而挡住光束，因而调制成一定频率的交变光束。

之后扇形镜在旋转时，将此交变光束交替地投射到参比溶液(空白溶液)及试样溶液上，后面的光电倍增管接受通过参比溶液及为试样溶液所减弱的交变光通量，并使之转变为交流信号。

此信号经适当放大并用解调器分离及整流。

然后以电位器自动平衡此两直流信号的比率，并为记录器所记录而绘制吸收曲线。

现代仪器在主机中装有微处理机或外接微型计算机，控制仪器操作和处理测量数据，组装有屏幕显示、打印机和绘图仪等。

任何一种分光光度计，基本上都是由五部分组成。

即光源、单色器、样品吸收池、检测器、记录系统。

三、实验步骤
1．打开仪器及计算机、显示器、打印机电源，进入软件操作系统，待仪器自检结束，点击OK，进入操作主页面。

2．波长扫描
（1）确定波长扫描参数
（2）做基线
将盛有参比液的比色皿分别放入参比光路和样品光路，点击“Baseline”开始进行基线扫描。

（3）波长扫描
将盛有样品和参比液的比色皿分别放入参比光路和样品光路，点击“Scan”开始扫描。

（4）定性分析
将试样的波长扫描图与已知样的在相同条件下的波长扫描图或已知的谱图相比较，对试样进行定性分析。

3．结果储存，输入选择的路径与文件名。

4．关闭计算机及仪器电源。

四、结果分析
1．苯
以乙醇作为溶剂
200250300350400
2
4
6
8
10
A λ / nm
由上图分析可知：
204nm ：中等强吸收带，为E 2带，由由 1A 1g → 1E 1u 跃迁所产生的，落在近紫外
区，也称主带。

253nm ：弱吸收带，为精细结构吸收带，亦称B 带，由 1A 1g → 1B 2u 跃迁和苯环
的振动的重叠引起的，也称苯吸收带。

是苯环的特征吸收带。

其中，E 1带未曾显示出来，主要是其波长在185nm 处，仪器检测不到所致。

2．硝基苯
以甲醇作为溶剂
200250300350400450500
2
4
6
8
10
A λ / nm
由上图分析可知：
257nm：强吸收带，为K带，由π→π*跃迁引起的。

284nm：为B带，由π→π*跃迁和苯环的振动的重叠引起的
其中，R带（由n→π*跃迁引起，波长为330nm，εmax为125）未显示出来，原
因是吸收强度太弱所致。

分析以上两谱图可知：当苯环上有取代基时，苯的特征谱带都会发生显著的
变化，其中影响较大的是E2带和B谱带，会发生明显红移。

五问题讨论
1．如何简单测试仪器工作正常。

答：检测波长范围、波长准确度、波长重复性、谱带半宽度、杂散光、分辨率、
光度准确度、光度计线性、光度计重复性、噪音、基线稳定性等主要性能指标是
否正常。

2.无机与有机试样测定时，有什么不同？
答：吸收的波长范围不同，用的溶剂也对应的不同。

3．吸光度太大或太小，如何解决？
答：应选择合适的溶剂，配成适当的浓度。

一般样品溶液的浓度范围约10—
20ug/ml，长共轭体系的样品浓度小于10 ug/ml,，只含有生色团和助色团的化
合物其浓度范围在100 ug/ml,以上，适合的样品溶液的吸收度在0.3—0.7之间，
吸光度太小应适当加大浓度，太大用溶剂稀释到适当浓度。

4.试样不出峰，为什么？如何解决？
答：1、检查是否在所选的波长范围内，不出峰可适当调整所选的波长范围。

另
外看所配的溶液浓度是否合适，如果不出峰可适当增加浓度。

2、记录器是否正常工作：
（1）记录器：电平值选择太高或者太低，应在中间部分。

（2）最小峰面积设置太大。

3、检测器部分：
（1）先判断极化电压有没有加上（260V左右）。

用万用表直流电压1000V 档一端接接线排上极化电压处，另一端接机壳，若显示260左右，说明极化电压
没有问题。

（2）检查离子头信号线有无问题。