RP-HPLC法同时测定壮药清解雾化液4种成分含量
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基金项目:广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项制剂类课题资助项目和医院制剂遴选课题(GZYZ1104);全国中药特色技术传承人才培训项目(J20164811007)㊂作者简介:秦素红(1988-),女,汉族,硕士,主管药师,研究方向中药新制剂㊁新剂型研发㊂E -mail:susu1437@通信作者:莫小林(1974-),女,汉族,本科,副主任中药师,研究方向为制剂开发和质量标准㊂E -mail:moxia-olin@RP -HPLC 法同时测定壮药清解雾化液4种成分含量秦素红1 莫小林1∗ 周雨晴1 马家宝1 杜沛霖21.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023;2.广西中医药大学,广西 南宁 530023ʌ摘 要ɔ 目的:建立RP -HPLC 同时测定壮药清解雾化液中绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷4种指标成分的含量测定方法㊂方法:应用日本岛津LC -20A 高效液相色谱仪,SPD -20A 检测器,WondaCract ODS -2(4.6mm ˑ250mm,5μm)色谱柱,以乙腈溶液(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱;流速1.0mL /min,检测波长355nm,柱温35ħ㊂结果:绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷的进样量分别在2.22~5.55μg㊁0.330~0.825μg㊁0.208~0.52μg㊁0.3485~0.8713μg 范围内线性关系良好(R 2ȡ0.9997);加样回收率为97.5%~102.35%,RSD 值为1.15%~2.14%㊂结论:该方法专属性㊁稳定性㊁重复性高,灵敏㊁简便,可应用于壮药清解雾化液制备工艺质量控制㊂ʌ关键词ɔ 壮药清解雾化汤;绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷;RP -HPLC ʌ中图分类号ɔR29ʌ文献标志码ɔAʌ文章编号ɔ1007-8517(2019)13-0061-03Simultaneous Determination of Four Chemical Components in Qingjie Atomized Liquid by RP -HPLCQIN Suhong 1 MO Xiaolin 1∗ ZHOU Yuqing 1 MA JiaBao 1 DU Peilin 21.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM,Nanning 530023,China;2.Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,China Abstract :Objective To develop an RP -HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid,rutin,hyperosideand isoquercitrin in Qingjie Atomized Liquid.Methods Separation was carried out an WondaCract ODS -2(4.6mm ˑ250mm,5μm),eluted with mobile phase of 0.2%phosphoric acid solution (B)-acetonitrile (A)in gradient mode.The flow rate was 1.0mL /min.Column temperature was 35ħand detection wavelength was set at 355nm.Result Linearity was good for chlorogenic acid,rutin,hyperoside and isoquercitrin in range of 2.22~5.55μg,0.330~0.825μg,0.208~0.52μg,0.3485~0.8713μg.respec-tively,Average recoveries of 4compounds were 97.5%-102.35%,RSD (1.15%-2.14%).Conclusion The method is accu-rate,stable,repeatable,sensitive and simple,can be used for quality control of Qingjie Atomized Liquid.Key words :Qingjie Atomized Liquid;chlorogenic acid,rutin,hyperoside and isoquercitrin;RP -HPLC壮药清解雾化液为广西中医药大学第一附属医院在研医疗机构制剂,由桑叶㊁千里光㊁岗梅根㊁一点红等壮药材组方,具有疏风清热㊁解毒利咽的功效[1]㊂经查阅文献,组方药材中的化学成分包括生物碱㊁黄酮类和咖啡酰奎宁酸类等[2-4],本文对其主要有效成分为芦丁㊁绿原酸㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷进行研究,建立RP -HPLC 同时测定4种指标成分的含量测定方法,为完善壮药清解雾化液质量标准提供依据㊂1 仪器与材料1.1 仪器 LC -20AT 高效液相色谱仪(日本岛津公司);KQ -250DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);GH -25电子分析天平(日本A&D 公司);CD -UPT 超纯水机(成都越纯科技有限公司);H1650医用离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)㊂1.2 试药 岗梅根㊁一点红㊁千里光㊁桑叶药材(由广西南宁万宝堂药业提供),经广西中医大学田辉教授鉴定符合2015年版‘中国药典“一部各品种项下标准㊂绿原酸(批号:110753-201413)㊁芦丁(批号:100080-201409)㊁金丝桃苷(批号:111521-201405)㊁异槲皮苷(批号:111809-201402)等对照品购自中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯(美国Fisher公司),水为超纯水,其他试剂均为分析纯(成都市科龙化工试剂厂)㊂2 方法与结果2.1色谱条件色谱柱:WondaCractODS-2(4.6mmˑ250mm,5μm);流动相:乙腈溶液(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脱(见表1);流速:1.0mL/min;检测波长:355nm;柱温:35ħ;进样量:20μL㊂色谱图如图1所示㊂表1 梯度洗脱时间程序时间/min流动相A%流动相B%0~2012~1788~8320~3017~1883~8230~4518~3082~7045~6030~4070~602.2 供试品溶液精密移取壮药清解雾化液25mL,水浴蒸干,甲醇溶解转移至25mL容量瓶,超声处理30min,放冷,精密加入甲醇定容至刻度线,摇匀,10000/min离心5min,取上清液,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得壮药清解雾化液供试品㊂2.3 阴性对照溶液按照壮药清解雾化液组方工艺配制缺少千里光的阴性样品,再按 2.2 项下方法制备缺千里光阴性对照液;同上配制缺少一点红㊁千里光㊁桑叶的阴性样品,制备缺一点红㊁千里光㊁桑叶阴性对照样品㊂2.4 混合对照溶液精密称取对照品绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷,加甲醇溶解制成对照品母液㊂再精密依次吸取一定体积对照品母液于同一容量瓶,甲醇定容得浓度依次为0.2220mg/ mL㊁0.033mg/mL㊁0.0208mg/mL㊁0.03485mg/mL的混合对照品溶液,0.45μm滤膜滤过备用㊂2.5 线性关系考察精密量取混合对照品溶液10㊁12㊁15㊁18㊁20㊁25μL,分别进样分析㊂以峰面积为纵坐标,对照品含量为横坐标进行线性回归㊂结果见表2㊂表2 绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷回归方程及线性范围对照品回归方程R2线性范围/μg 绿原酸Y=1099082X+587400.9999 2.22~5.55芦丁Y=1744952X-126510.99970.330~0.825金丝桃苷Y=2089855X-6779 1.00000.208~0.520异槲皮苷Y=2346441X+127650.99990.3485~0.8713 2.6 精密度考察取 2.2 项下壮药清解雾化液供试品溶液,连续6次进样20μL,依法测定记录绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷峰面积, RSD依次为1.4%,1.7%,2.2%,1.2%,表明精密度良好,达到测定要求㊂2.7 稳定性试验取壮药清解雾化液供试品溶液,分别于室温下0,4,8,12,24,36h进样20μL,依法测定,记录绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷峰面积,RSD分别为1.9%,2.4%,2.9%, 1.8%,说明壮药清解汤供试品溶液在36h内稳定性良好,达到测定要求㊂2.8 重复性试验按照 2.2 项下壮药清解雾化液供试品制备方法,平行制备壮药清解雾化液供试品溶液6份,按照2.1项的色谱条件进行测定,结果绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷的平均含量分别为0.1948㊁0.0214㊁0.0204㊁0.0280mg/mL,RSD依次为2.0%,2.5%, 2.7%,1.8%,参照2015年版‘中国药典“四部药品质量标准方法验证指导原则准确度项下样品待测定成分含量和回收率限度要求,待测定成分含量0.01%,重复性RSD可接受范围为小于4,良好,达到测定要求㊂2.9 加样回收率考察精密移取已测定含量的壮药清解汤6份各10mL,分别精密加入绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷混合对照品溶液适量,按照 2.2 项下壮药清解汤供试品制备方法液,按 2.1 项色谱条件测定,绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷回收率在96.7%~103.5%,结果见表3㊂参照2015年版‘中国药典“四部药品质量标准方法验证指导原则准确度项下样品待测定成分含量和回收率限度要求,待测定成分含量0.01%,回收率限度(%)范围为85~110;结果表明,符合含量测定的要求㊂表3 绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷的加样回收率(n=6)对照品样品量/mg加入量/mg测得量/mg回收率%RSD 绿原酸 1.9569 1.6650 3.3723103.5 1.5芦丁0.21490.24780.454596.7 2.8金丝桃苷0.20470.20800.405797.6 2.5异槲皮苷0.28050.27880.5638101.6 3.5 2.8 样品含量测定按既定工艺制3批壮药清解汤样品,每批样品按 2.2 项下方法分别制备3份壮药清解汤供试品溶液,按 2.1 项色谱条件进样测定分析,记录色谱峰面积,根据绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷的标准曲线,计算各成分含量㊂结果见表4㊂表4 壮药清解汤中绿原酸㊁芦丁㊁金丝桃苷㊁异槲皮苷的含量测定结果(n=3)批次绿原酸/mg/mL芦丁/mg/mL金丝桃苷/mg/mL异槲皮苷/mg/mL 201609100.19570.02140.02050.0281 201610170.19410.02150.02040.0279 201612060.19490.02140.02040.02803 讨论壮药清解雾化液处方包括壮药材桑叶㊁千里光㊁岗梅根㊁一点红;组方药材均为功效类似状药,具有相同的有效成分㊂经文献查阅,一点红㊁桑叶均含有绿原酸㊁芦丁㊁异槲皮苷,千里光含金丝桃苷㊁绿原酸㊁芦丁㊁槲皮素等[2-4]㊂本研究通过保留时间和千里光专属成分金丝桃苷为参照的相对保留时间共同确定绿原酸㊁芦丁㊁异槲皮苷的色谱峰㊂检测波长与流动相的确定:参照2015年版‘中国药典“,千里光含量测定项金丝桃苷检测波长360nm;绿原酸检测波长是327nm;芦丁与异槲皮苷的苷元都是槲皮素,在358nm有最大吸收;结合试验测定以355nm作为检测波长[5]㊂以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱;试验中混合对照品和壮药清解雾化液中四种成分均达到基线分离,基线平稳,峰型对称,色谱峰分离度大㊂本研究对壮药清解雾化液3个批次进行含量测定,4个成分含量差异较小,说明壮药清解雾化液质量稳定㊂综上,本研究建立的方法稳定㊁准确,重复性强,可为壮药清解雾化液质量控制提供参考㊂参考文献[1]莫小林,伍小燕,龚敏阳,等.状药清解雾化液质量标准研究[J].中国药业,2017,26(10):27-30.[2]沈寿茂,沈连钢,张晶,等.一点红HPLC指纹图谱研究及咖啡酰奎宁酸类成分的含量测定[J].中华中医药杂志,2014,29(12):3790.[3]张朝凤,陈录新,张勉,等.千里光药材的HPLC指纹图谱及ESI-MS分析[J].中国中药杂志,2008, 33(18):2093.[4]朱立华,李跃辉,胥新元,等.不同产地千里光药材中金丝桃苷和绿原酸含量的比较研究[J].湖南中医杂志,2013,29(10):128.[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部) [M].北京:中国医药科技出版社,2015:34(收稿日期:2019-04-22 编辑:刘斌)。