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Ⅰ型 IFN 体外增强人 γδT 细胞对骨肉瘤的杀伤作用

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doi ：10．3969/j．issn．1000-484X．2014．11．021Ⅰ型IFN 体外增强人γδT 细胞对骨肉瘤的杀伤作用①李朝旭王锐英唐际存②（桂林医学院附属医院骨二科，桂林541004）中图分类号Ｒ392.12文献标志码A文章编号1000-484X （2014）11-1533-04①本文为国家自然科学基金资助项目（81360400）。

②通讯作者，E-mail ：tangjicun@126．com 。

作者简介：李朝旭（1977年－），男，博士，副主任医师，主要从事骨与软组织肿瘤的生物治疗研究，E-mail ：lzxpds@126．com 。

［摘要］目的：探讨Ⅰ型干扰素（IFN ）对人来源γδT 细胞杀伤骨肉瘤作用的影响。

方法：取健康人和骨肉瘤患者外周血来源的单个核细胞，分别使用唑来膦酸（Zol ）、Zol 和Ⅰ型IFN 体外刺激扩增，流式细胞技术检测γδT 细胞的纯度，计算扩增倍数。

以Zol 刺激体外扩增的γδT 细胞为对照组，Zol 联合Ⅰ型IFN 刺激体外扩增的γδT 细胞为实验组，LDH 法检测不同方法扩增的γδT 细胞的细胞毒活性，ELISA 法检测γδT 细胞分泌的IFN-γ。

结果：Zol 、Zol 联合Ⅰ型IFN 均可高度选择性扩增健康人和骨肉瘤患者外周血单核细胞中的γδT 细胞，扩增后γδT 细胞具有杀伤骨肉瘤细胞的能力。

Ⅰ型IFN 预处理γδT 细胞后可显著增强γδT 细胞的杀伤活性。

结论：Ⅰ型IFN 能够促进人γδT 细胞的抗骨肉瘤作用。

［关键词］骨肉瘤；γδT 细胞；干扰素；细胞毒活性；免疫治疗Type ⅠIFN-mediated enhancement of anti-osteosarcoma cytotoxicity of humangammadelta T cellsLI Zhao-Xu ，WANG Ｒui-Ying ，TANG Ji-Cun .Department of Orthopaedics No .2，Affiliated Hospital of Guilin Medical University ，Guilin 541004，China ［Abstract ］Objective ：To investigate the effect of type ⅠIFN on the cytotoxic activity of γδT cells from peripheral blood mono-nuclear cells （PBMCs ）of healthy donors and osteosarcoma patients stimulated by zoledronate （Zol ）and IL-2against OS.Methods ：PBMCs from healthy donors and osteosarcoma patients were stimulated with Zol +IL-2or Zol +IL-2+type ⅠIFN ，respectively.After 14days of culture ，ex vivo expanded γδT cells were assessed by flow cytometry.γδT cell cytotoxicity against target cells was analyzed u-sing a standard lactate dehydrogenase release assay.IFN-γsecreted from γδT cells was determined by ELISA kits.Ｒesults ：γδT cells from PBMCs of healthy donors and patients with OS were selectively expanded by Zol +IL-2or Zol +IL-2+type ⅠIFN in vitro ，re-spectively ，and showed cytotoxicity against OS.In addition ，γδT cells pre-treated by Type ⅠIFN showed significantly higher cytotoxicity against OS cells.Conclusion ：Type I IFN can enhance human γδT cells ’cytotoxic activity against OS.［Key words ］Osteosarcoma ；γδT cell ；IFN ；Cytotoxicity activity ；Immunotherapy免疫治疗是恶性肿瘤的有效治疗方法之一，其中过继免疫细胞治疗是目前研究的热点。

γδT 细胞与αβT 细胞不同，对肿瘤细胞的识别、杀伤显现出MHC 非限制性，因此γδT 细胞作为种子细胞的过继免疫治疗越来越受到人们的关注［1］。

尽管越来越多的研究表明γδT 细胞对多数肿瘤具有杀伤作用，但是由于肿瘤存在多种的抑制性因素，影响了γδT细胞进一步应用，因此，如何提高γδT 细胞肿瘤免疫治疗效果成为目前急需解决的问题［2］。

我们先前研究显示，Ⅱ型干扰素-γ（Interferon ，IFN-γ）通过Fas /FasL 途径增强人来源的γδT 细胞对骨肉瘤（Osteosarcoma ，OS ）的杀伤作用［3，4］。

但是作为目前已广泛临床应用的Ⅰ型IFN ，能否增强人γδT 细胞识别和杀伤OS 的作用未见报道。

本研究观察Ⅰ型IFN 体外刺激人γδT 细胞的抗OS 细胞的效应，拟为OS 患者的免疫辅助治疗提供科学依据。

1材料与方法1.1材料人骨肉瘤细胞系HOS 购自中国科学院上海细胞所。

唑来膦酸（Zoledronate ，Zol ）为瑞士诺华制药公司产品，人重组白介素2（Interleukin-2，IL-2），Ⅰ型IFN ：IFN-α、IFN-β购自上海普欣生物有限公司。

淋巴细胞分离液购自加拿大Cedarlane 公司，CytoTox 96 非放射性细胞毒性试剂盒为Promega 公司产品，人IFN-γELISA 试剂盒购自美国eBio-science 公司。

鼠抗人TCＲ-γδ-PE 抗体、CD3-FITC 抗体为美国eBioscience 公司产品。

Cytomics TM FC500型流式细胞仪为美国Beckman-Coulter 公司。

胎牛血清、ＲPMI1640干粉为Gbico 公司产品。

1.2方法1.2.1γδT细胞制备和鉴定取人静脉抗凝血5 ml，磷酸缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS）1ʒ1稀释，用淋巴细胞分离液分离获取人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），取24孔培养板，每孔加入1ml细胞悬液，培养液为含100ml/L的胎牛血清的ＲPMI1640培养液，细胞密度为1ˑ106 2ˑ106ml；培养第1天加入Zol1μmol/L和人rIL-2400U/ml；以后每3d更换一半含人rIL-2400U/ml或Ⅰ型IFN：IFN-α和IFN-β400U/ml的新鲜培养液，培养14d收获γδT细胞，加入抗人TCＲ-γδ-PE mAb2μl和抗人CD3-FITC mAb1μl后4ħ避光孵育30min，流式细胞技术检测γδT细胞的纯度，计算扩增倍数。

公式：扩增倍数=（扩增后总细胞数ˑ扩增后γδT细胞的纯度）/（扩增前总细胞数ˑ扩增前γδT细胞的纯度）［5］。

1.2.2细胞毒性试验以人骨肉瘤细胞系HOS为靶细胞，设置不同效靶细胞比，根据乳酸脱氢酶释放法检测的操作说明，检测并计算γδT细胞的细胞毒性［5］。

1.2.3γδT细胞分泌的IFN-γ水平的检测按照以前我们研究方案［6］，根据人IFN-γELISA试剂盒的操作说明，检测并绘制标准曲线，计算IFN-γ浓度。

1.3统计学分析数据以xʃs表示，χ2检验比较γδT细胞的细胞毒性和IFN-γ分泌变化有无统计学意义，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果2.1γδT细胞的体外扩增4例健康人志愿者和10例骨肉瘤患者（其中4例原发性骨肉瘤，3例复发性骨肉瘤和3例转移性骨肉瘤）参与本研究、其中健康人志愿者和骨肉瘤患者γδT细胞的纯度在扩增前依次分别为（2.4ʃ1.7）%和（2.2ʃ0.9）%，两者无统计学差异；经过Zol体外刺激诱导2周后，γδT细胞的纯度达到（93.2ʃ2.0）%，其中健康人志愿者γδT细胞的纯度为（94.6ʃ1.6）%，骨肉瘤患者为（91.8ʃ0.6）%，无统计学差异；扩增倍数为（290.4ʃ73.1）倍，其中健康人志愿者γδT细胞的扩增（398.4ʃ73.1）倍，骨肉瘤患者为（162.4ʃ83.2）倍，两者有统计学差异（P＜0.01）。

2.2Ⅰ型IFN对γδT细胞的增殖影响分别使用IFN-α、IFN-β联合Zol体外刺激诱导14d后，γδT 细胞的纯度分别为（91.9ʃ1.0）%和（90.9ʃ1.3）%，其中健康人志愿者γδT细胞的纯度分别为（93.6ʃ1.2）%和（94.1ʃ2.1）%，骨肉瘤患者分别为（90.2ʃ0.8）%和（88.9ʃ1.7）%，与Zol组相比均无统计学差异（P＞0.05）；扩增倍数分别为（272.4ʃ83.2）倍和（262.4ʃ77.6）倍，其中健康人志愿者γδT细胞的扩增分别达到（432.4ʃ80.2）倍和（392.4ʃ97.3）倍，骨肉瘤患者为分别达到（172.4ʃ83.2）倍和（162.4ʃ70.1）倍，骨肉瘤患者与健康人的γδT细胞的扩增有统计学差异（P＜0.01）；但与Zol组相比，IFN-α组和IFN-β组骨肉瘤患者γδT细胞的扩增无统计学差异（P＞0.05）。

2.3Ⅰ型IFN对健康人γδT细胞杀伤活性的影响图1为健康人γδT细胞在1.5ʒ1、3ʒ1、6ʒ1和12ʒ1的效靶比下，对HOS细胞的杀伤作用。

在较低效靶比情况下，健康人γδT细胞对HOS细胞的杀伤作用较弱，但是分别使用IFN-α、IFN-β预处理γδT细胞72h后，健康人γδT细胞对HOS细胞的杀伤作用显著增强，结果具有显著统计学差异（P＜0.01）。

2.4Ⅰ型IFN对骨肉瘤患者γδT细胞杀伤活性的影响图2显示，不同类型骨肉瘤患者PBMCs来源的γδT细胞在效靶比为3ʒ1时，对HOS细胞杀伤率较弱。

分别使用IFN-α、IFN-β预处理γδT细胞72h 后，骨肉瘤患者PBMCs来源的γδT细胞对骨肉瘤细胞杀伤活性显著增加（P＜0.05）。

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ifn-γ名词介绍

ifn-γ名词介绍

ifn-γ名词介绍
IFN-γ是一种细胞因子，全称为干扰素γ（Interferon gamma）。

它是由T淋巴细胞、自然杀伤细胞和一些其他免疫细胞产生的蛋白质。

IFN-γ在免疫系统中发挥着重要的作用，能够增强机体的免疫力，抵御病原体的侵袭。

IFN-γ主要的作用有：
1. 增强巨噬细胞的吞噬能力和杀伤能力，促进巨噬细胞的活化和分化。

2. 促进T淋巴细胞的分化和增殖，增强T淋巴细胞的杀伤能力。

3. 抑制病毒和细胞的生长，抑制肿瘤细胞的增殖。

4. 促进免疫细胞的迁移和趋化，增强免疫细胞的活性。

学习英语时，了解医学术语和生物学术语是非常重要的。

对于IFN-γ这样的专业术语，可以通过以下学习技巧来掌握：
1. 查阅相关的医学或生物学词典，了解其定义和用法。

2. 阅读相关的医学或生物学文献，了解IFN-γ的研究进展和应用。

3. 学习相关的语法和词汇，例如名词的复数形式、动词的时态和语态等。

4. 练习听、说、读、写，加强对IFN-γ的理解和应用能力。

总之，学习英语需要不断积累词汇和语法知识，同时也需要了解相关的专业术语和知识。

通过多种学习方式和技巧，可以更好地掌握英语知识，提高英语水平。

自然杀伤T细胞和γδT细胞

自然杀伤T细胞和γδT细胞

γδT细胞γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。

γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞。

1简介γδT细胞是执行固有免疫功能的T细胞，其TCR由γ和δ链组成。

此类T细胞主要分布于肠道呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，在外周血中只占CD3+T细胞的0.5%-1%。

其TCR缺乏多样性，可直接识别某些完整的多肽抗原。

γδ T细胞所识别的抗原种类有限：①HSP；②感染细胞表面CD1分子提成的脂类抗原；③某些病毒蛋白或表达于感染细胞表面的病毒蛋白；④细菌裂解产物中的磷酸化抗原。

γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。

因此，它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。

同时，γδT细胞主要分布于皮肤和黏膜组织上，因此对于黏膜方面的癌症治疗效果突出，比如消化道、呼吸道、生殖系统方面的癌症效果显著。

2治疗作用①γδT细胞能够与多种免疫细胞发生作用，参加抗肿瘤免疫应答。

②γδT细胞能够在肿瘤发生的早期阶段迅速引起有效的抗肿瘤免疫应答。

③γδT细胞在抗肿瘤免疫过程中具有重要的保护作用。

④γδT能够利用细胞毒效应杀伤肿瘤细胞，防止肿瘤的发生发展。

⑤γδT细胞能够分泌相关因子，这些因子能够放大肿瘤信号。

⑥γδT细胞能分泌穿孔素，诱导肿瘤细胞凋亡。

目的:探讨外周血γδT细胞经唑来膦酸刺激后对骨肉瘤细胞株HOS的体内外杀伤作用及相关机制。

方法:取健康人外周血5 mL,经唑来膦酸刺激后,在含IL-2的培养液中,培养14 d。

用流式细胞仪测定γδT细胞所占的比例,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其对骨肉瘤细胞株HOS的体外杀伤作用,并用抗人γδTCR抗体、抗人NKG2D抗体和穿孔素/颗粒酶阻滞剂CMA 分别预处理γδT细胞,观察杀伤作用的变化。

干扰素(IFN)

干扰素(IFN)

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。

干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。

它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

目录1干扰素2干扰素简介3治疗有效率4干扰素多少钱5发现6什么叫干扰素（IFN）7品种及价位8作用机制1.8.1 ①间接性2.8.2 ②广谱性3.8.3 ③种属特异性4.8.4 ④发挥作用迅速1干扰素药物类别：抗肿瘤药，抗病毒药；所属类别：生物反应调节剂药物名称：干扰素英文名称：Interferon药物别名：序号中文别名英文别名一．α干扰素制剂/规格：序号制剂规格1．注射剂 5×10。

单位（1 ml）；1×106。

单位（1 ml）；2．冻干剂l×10。

单位成份/化学结构：序号成份化学结构药理作用：1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它一般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。

当病毒感染的恢复期可见干扰素的存在，另一方面用外源性干扰素亦可缓解感染。

2．抑制细胞增殖干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大500～1000倍。

干扰素抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。

3．诱导细胞凋亡：干扰素可以诱导肿瘤细胞凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。

4.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。

药动学：干扰素在肌内注射或皮下注射后入血的速度较慢，需较长时间才能在血中测到。

肌内注射后Tmax为5～8小时。

一次肌注：106单位，血清浓度为100单位/ml，这比在病毒感染时自然产生的干扰素量为高。

干扰素

干扰素

干扰素中文名称：干扰素英文名称：interferon;IFN定义1：细胞因子中的一个家族，以干扰病毒复制而得名。

根据产生细胞不同可分为α干扰素、β干扰素和γ干扰素三类。

所属学科：免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科）定义2：脊椎动物受多种因素(如微生物)诱导产生的一组抗病毒蛋白质。

可影响细胞的运动和免疫过程，也可干扰多种病毒的复制而得此名。

干扰素有Ⅰ型和Ⅱ型，以及干扰素样细胞因子，Ⅰ型干扰素有7种：IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ，人类没有IFN-δ和IFN-τ；Ⅱ型仅有IFN-γ。

所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；激素与维生素（二级学科）定义3：抑制病毒在细胞内增殖的一类活性蛋白质。

所属学科：水产学（一级学科）；水产生物病害及防治（二级学科）定义4：因最初发现某一种病毒感染的细胞能产生一种生物学活性物质可干扰另一种病毒的感染和复制而得名。

是最早发现的细胞因子。

根据干扰素产生的来源和结构不同可分为α干扰素、β干扰素和γ干扰素三类。

所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞免疫（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布百科名片干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。

它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

干扰素简介70年代中期人们发现慢性乙型肝炎患者自身产生干扰素的能力低下，在应注射用重组人干扰素α-2a用外源性干扰素后，不仅产生了上述抗病毒作用，同时可以增加肝细胞膜上人白细胞组织相容性抗原的密度，促进T细胞溶解感染性肝细胞的效能。