天麻提取物的提取_纯化工艺研究

天麻提取物的提取、纯化工艺研究洪燕龙1,　徐德生13,　冯　怡2,　袁　莹2(1.上海中医药大学附属曙光医院,上海200021;2.上海中医药大学中药学院,上海201203)收稿日期:2007201212基金项目:上海市重点学科建设项目资助,项目编号:T0301作者简介:洪燕龙(1978～),男,博士,研究方向:中药新剂型与新技术,E 2mail:hfuir@s ohu .com 。

3通讯作者:徐德生,博士生导师,电话:021*********,E 2mail:xudes1953@ 。

关键词:天麻;天麻素;提取;纯化摘要:目的:对天麻提取物的提取、纯化工艺进行优化研究。

方法:以天麻素为主要指标,采用单因素及正交试验设计考察提取、纯化工艺参数的最佳组合。

结果:提取、纯化后天麻提取物的出膏率为5.38%,其中含天麻素8.45%。

结论:本实验研究为天麻药材及其制剂的开发提供有益的实验依据。

中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:100121528(2008)0120204203 天麻为名贵中药,具有平肝熄风、止痉之功效,用于治疗头晕目眩、小儿惊风、癫痫等症。

现代医学认为[1]天麻具有镇静、抗惊厥、镇痛、降压、增加脑血流量和冠脉流量、抑制血小板聚集等作用,其含有的化合物主要有酚类、有机酸类、甾醇类、多糖、鞣质等,其中天麻素在镇静、抗惊厥、安眠、降压[2]以及抑制血小板释放52HT (52羟色胺)[3]等方面具有较强的生理活性。

本试验以天麻素为主要考察指标,采用单因素及正交试验系统研究了天麻提取物的提取、纯化工艺,为天麻及其制剂的开发提供有益的实验依据。

1　仪器与试药Agilent 1100高效液相色谱仪;电子天平(北京分析仪器厂);乙腈(sig ma 公司,色谱纯);余试剂均为分析纯;大孔树脂购于南开大学化工厂及沧州保恩化工厂;天麻素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:1108072200205);天麻为兰科植物天麻(Gastrod ia elata BL.)的干燥块茎,经鉴定符合《中华人民共和国药典》(2005年版)天麻项下的规定,购自上海天桥中药饮片厂(批号:051205;产地:四川)。

2　方法与结果2.1　天麻素含量的HP LC 测定方法2.1.1　色谱条件[4]Kr omasil C 18柱(4.6mm ×250mm );流动相:乙腈20.05%磷酸(3∶97);柱温:25℃;检测波长:220n m;流速:1.0mL /m in;进样量:10μL;理论塔板数以天麻素计不低于5000。

2.1.2　对照品溶液的制备精密称取天麻素对照品6.15mg,置100mL 棕色量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得含天麻素61.5μg/mL 的对照品溶液,经稀释得到系列浓度的对照品溶液。

2.1.3　供试品溶液的制备天麻粗粉50g,70%乙醇回流提取2次,合并提取液,转移至1000mL 量瓶中,用水稀释至刻度。

精密吸取10.0mL 至100mL 量瓶中,加水至刻度,摇匀,微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.1.4　线性关系的考察分别精密吸取各对照品溶液10μL,按上述色谱条件测定,以天麻素对照品的进样量(μg )为横坐标,以峰面积(A )为纵坐标绘制标准曲线,计算得回归方程:Y =1868.3X -2.1123,r =0.9999,进样量在0.0615～0.6150μg 与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5　精密度试验精密吸取同一对照品溶液,重复进样5次,RSD =0.38%。

2.1.6　稳定性试验精密吸取同一对照品溶液,分别在0、1、2、4、6、8h 测定,RSD =0.27%。

2.1.7　重复性试验同一批号天麻药材按2.1.3项下方法平行制备5份,测定,RSD =2.21%。

2.1.8　回收率试验精密称取同一天麻药材,共6份,精密加入对照402品适量,按2.1.3项下方法平行制备,测定,平均回收率为99.72%,RSD =1.46%。

在上述色谱条件下,天麻素对照品、供试品溶液的色谱图见图1、图2。

图1　天麻素HP LC图谱图2　天麻药材HP LC 图谱2.2　提取工艺的研究天麻提取的预实验结果表明药材粒径对提取效果有显著的影响,饮片直接提取效率较低,因此天麻提取前须粉碎至粗粉(过20目筛)。

文献报道[5,6]:天麻可以水提取,亦可以稀醇提取,但水提取液黏稠,为后期的纯化工艺带来较大的困难。

因此选择一定浓度的乙醇回流提取。

2.2.1　提取溶剂的单因素考察实验发现:用较低浓度的乙醇提取,其提取液与水提取液具有类似的黏稠性。

因此,选择80%、70%、60%、50%的乙醇进行考察。

以60%乙醇提取,其天麻素提取量虽然较高,但出膏率亦较大,综合考虑选择70%乙醇进行提取。

实验结果见表1。

表1　单因素法考察提取溶剂乙醇浓度/%出膏率/%天麻素提取量/mg/g 浸膏中天麻素含量/mg/g8015.2 4.536429.847016.8 5.695133.906017.6 5.841433.195020.05.589727.952.2.2　醇提取工艺的正交试验考察选择L 9(34)正交表,以天麻素含量为评价指标,考察溶剂用量(A )、提取时间(B )和提取次数(C )对热回流提取效果的影响。

方差分析结果表明,溶剂用量及提取次数有显著性差异,结合极差分析结果天麻的最佳提取工艺组合为A 3B 1C 3,即10倍溶剂用量,提取3次,每次1h 。

因素水平表见表2,实验结果见表3、表4。

表2　天麻提取物提取正交试验因素水平水平溶剂用量/倍提取时间/h提取次数A B C 161128 1.5231023表3　天麻提取物提取正交试验方案及结果试验列号A B C 天麻素提取率/mg/g1111 5.20072122 5.58653133 5.71024212 5.61935223 5.73026231 5.33697313 5.96828321 5.53979332 5.7932Ⅰj5.4992 5.5961 5.3591Ⅱj 5.5621 5.6188 5.6664Ⅲj5.7670 5.6134 5.8029R0.26790.02280.4438表4　天麻提取物提取正交实验方差分析方差来源方差平方和自由度均方F 值显著性(P )A 0.11820.0588621.356<0.05B 0.000847220.00042360.154>0.05C0.31020.15556.230<0.05误差0.00551220.002756 注:F 0.05(2,2)=19.00,F 0.01(2,2)=99.002.2.3　正交试验法优化工艺的验证选择优化工艺70%乙醇、10倍量、提取3次、每次1h,天麻素平均提取率为5.9685mg/g (n =2),表明工艺较为稳定。

2.3　纯化工艺研究天麻的稀醇提取液含有较高含量的多糖及鞣质,极性较大,同时天麻素等效应成分的极性亦较大,用大孔树脂吸附法进行纯化效果不理想。

参考文献[7],采用醇沉2调pH 沉淀法。

2.3.1　样品溶液的制备取天麻粗粉500g,加70%乙醇,10倍量,提取3次,每次1h,滤过,合并提取液,浓缩至1000mL (相当于0.5g/mL ),5000r/m in 离心15m in,取上清液作为纯化工艺的样品溶液,冰箱放置,备用。

2.3.2　样品溶液浓度的考察502选择不同浓度的天麻样品溶液,加乙醇至醇含量70%,静置24h,滤过,加乙醇至醇含量90%,静置24h,滤过,加40%Na OH溶液调pH值至8.5,分别测定天麻素含量及出膏率。

当天麻样品溶液的浓度为4g/mL,转移率较高,而出膏率为4.59%,取得较满意的结果。

实验结果见表5。

表5　样品溶液浓度考察结果样品浓度/g/mL转移率/%出膏率/%0.598.3513.511.096.3412.412.097.259.284.088.96 4.592.3.3　醇沉液pH的考察取天麻样品溶液(4g/mL)加乙醇至醇含量70%,静置24h,滤过,加乙醇至醇含量90%,静置24h,滤过,分别加40%Na OH溶液调pH值至8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,分别测定天麻素含量及出膏率。

当pH值调至8.0,对天麻素的转移率和出膏率影响不大,选择pH值为8.0。

实验结果见表6。

表6　醇沉液pH的考察结果醇沉液pH转移率/%出膏率/%8.095.36 5.518.596.32 5.539.096.27 5.239.595.36 5.4910.094.58 5.012.3.4　醇沉液乙醇浓度的考察取天麻样品溶液(4g/mL)加乙醇至醇含量70%,静置24h,滤过;分别加乙醇至醇含量为70%、80%、90%,静置24h,滤过;各加40%Na OH 溶液调pH值至8.0,测定天麻素含量及出膏率。

醇沉浓度对出膏率及天麻素的转移率影响不大,为节约乙醇用量,选择70%为醇沉浓度,实验结果见表7。

表7　醇沉液乙醇浓度的考察结果乙醇浓度/%转移率/%出膏率/% 7096.35 5.538094.28 5.239094.56 5.492.4　提取、纯化优化工艺验证经考察天麻提取物的提取、纯化工艺为:取天麻粗粉一定量,加70%乙醇,10倍量,提取3次,每次1h,滤过,合并滤液,减压回收乙醇,浓缩至相当于生药0.5g/mL,5000r/m in离心15m in,取上清液,减压浓缩至相当于生药4g/mL,加乙醇至醇含量70%,静置24h,滤过,加40%Na OH溶液调pH值至8.0,静置24h,滤过,减压回收乙醇,真空干燥。

称取天麻粗粉500g。

平行3份,按上述工艺进行提取、纯化,实验结果见表8。

参考文献液相条件[8],纯化前后的HP LC指纹图谱见图3、图4。

表8　天麻提取物提取、纯化结果批号出膏率/%转移率/%浸膏中天麻素含量/%082201 5.6396.358.53082202 5.2194.288.23082301 5.3494.568.49图3　天麻药材的HP LC指纹图图4　天麻纯化后的HP LC指纹图3　讨论3.1　本文系统考察了天麻提取物的提取、纯化工艺,其出膏率约为5.38%,天麻素含量为8.45%,天麻素富集了近14倍,天麻纯化前后的HP LC图亦验证了本实验结果。

3.2　川芎、天麻共同组成了治疗偏头痛的传统名方大川芎丸。

川芎提取物(其提取、纯化工艺另篇报道)与天麻提取物按原方比例给药后,可显著提高醋酸扭体小鼠的扭体抑制率,并可提高硝酸甘油偏头痛大鼠血浆中的52HT含量,初步证实了天麻提取物的药理效应。

3.3　天麻素属于一种酚苷,分子量较小,极性较大,按常规水煎煮提取即可,但本实验表明,用70%乙醇进行提取,有效成分提取更完全,这是由于天麻中含有较多的淀粉,水煎煮液黏稠不利于有效成分的扩散、溶出。