104.水中总大肠菌群复习试题(多管发酵法)

生活饮用水微生物指标总大肠菌群1.项目概述本实验依据GB-T5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法总大肠菌群多管发酵法。

总大肠菌群指一群在37℃培养24 h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。

本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。

2.培养基与试剂2.1 乳糖蛋白胨培养液2.1.1 成分A蛋白胨10 gB牛肉膏3gC乳糖5gD氯化钠5gE溴甲酚紫乙醇溶液(16 g/L) 1mLF 蒸馏水1000 mL2.1.2 制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2～7.4，再加入1 mL16 g/L的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68. 95 kPa (115℃．10 lb)高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。

2.2 二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液(2.1.1)，除蒸馏水外，其他成分量加倍。

2.3 伊红美蓝培养基2.3.1 成分A蛋白胨10 gB乳糖10 gC磷酸氢二钾2gD琼脂20 g～30 gE 蒸馏水1000 mLF伊红水溶液(20 g/L) 20 mLG美蓝水溶液(5 g/L) 13 mL2.3.2 制法将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加入乳糖，混匀后分装，以68.95 kPa(115℃，10 lb)高压灭菌20 min。

临用时加热融化琼脂，冷至50℃～55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。

2.4 革兰氏染色液2.4.1 结晶紫染色液A成分：a结晶紫 1 gb乙醇（95%，体积分数）20 mLc草酸铵水溶液(10 g／L) 80 mLB制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。

结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。

2.4.2 革兰氏碘液A成分：a碘1gb碘化钾 2 gc蒸馏水300 mLB制法：将碘和碘化钾先进行混台，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。

总大肠菌群多管发酵法测定步骤# 总大肠菌群多管发酵法测定步骤的理论研究大家好，我是这个领域的一名专家。

今天我要和大家分享一下关于总大肠菌群多管发酵法测定步骤的一些理论问题。

我们要知道什么是总大肠菌群。

简单来说，总大肠菌群就是肠道里的一种微生物群落，它们的数量可以反映出一个人是否健康。

而测定总大肠菌群的方法有很多种，其中最常用也最准确的一种是多管发酵法。

那么，多管发酵法是怎么测定总大肠菌群的呢？简单来说，就是将待测样品中的总大肠菌群接种到不同的培养基上进行培养，然后通过观察不同培养基上的菌落生长情况来判断总大肠菌群的数量。

在实际操作中，我们需要准备几个不同的培养基，每个培养基上都涂上一层薄薄的液体。

然后将待测样品中的总大肠菌群接种到这些培养基上，再将这些培养基放入恒温箱中进行培养。

在这个过程中，我们需要注意一些细节。

比如，培养的时间需要控制好，不能太长也不能太短；培养的温度也需要控制好，不能太高也不能太低；还有，培养基的选择也很重要，要选择适合总大肠菌群生长的培养基。

经过一段时间的培养后，我们就可以观察各个培养基上的菌落生长情况了。

一般来说，如果某个培养基上的菌落数量较多，就说明在这个样品中总大肠菌群的数量较多；反之，如果某个培养基上的菌落数量较少，就说明在这个样品中总大肠菌群的数量较少。

我们就可以根据各个培养基上的菌落生长情况来计算出总大肠菌群的数量了。

这就是多管发酵法测定总大肠菌群的基本步骤。

总的来说，多管发酵法是一种非常准确、可靠的测定总大肠菌群的方法。

它的操作过程虽然复杂了一些，但是只要我们掌握了正确的方法和技巧，就能够准确地测定出样品中总大肠菌群的数量。

这对于我们了解肠道微生物群落的情况、预防肠道疾病等方面都有着重要的意义。

多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群李恒，等多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群Determination of Total Coliform Group and Fecal Coliform Group in Water by Multi-tube Fermentation and Paper Disk Method李恒张志君王光惠陈泓+（湖南省衡阳生态环境监测中心，湖南衡阳421000）［摘要］通过多管发酵法和纸片快速法对实际水样的总大肠菌群和粪大肠菌群进行实验比对，结果表明，两种方法的结果相差不大，但纸片快速法比多管发酵法操作简便、检测时间短，更适用于环境监测日常分析％［关键词］多管发酵法；纸片快速法；总大肠菌群;粪大肠菌群［中图分类号］X833［文献标识码］%引言粪大肠菌群是能在44.5!温度下生长并发酵乳糖产酸产气的耐热的大肠菌群，属于总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。

水中粪大肠菌群和总大肠菌群的检验是研究水体污染和环境卫生的重要指标，具有广泛的卫生学意义。

目前，国内已颁布的标准主要是多管发酵法和纸片快速法［1+4］。

多管发酵法操作繁琐且时间过长（48~72h$,难以满足当前环境监测工作的需求［5］%纸片快速法不仅培养时间短（18~ 24h）,且无需提前准备培养基，可以避免培养基杂菌入侵和时间过长等不足。

为更精确、快速、可靠地进行监测，本文用多管发酵法和纸片快速法同步进行对比实验，并对两种分析方法的实验结果进行了比较分析。

1材料与仪器1.1材料水质粪大肠菌群、总大肠菌群快速检验纸片（广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司）；粪大肠菌群、总大肠菌群、培养基、革兰氏染色液％1.2试剂EC培养基：胰豚20g,乳糖5g,胆盐三号1.5g，磷酸氢二钾4g,磷酸二氢钾1.5g,氯化钠5g%将上述成分加热溶于1000ml水中，灭菌后的pH应在6.9左右。

该培养基在低温无菌条件下可以保存一个月％无菌水：将纯水在115!高压蒸汽灭菌20min,备用。

总大肠菌群
一、填空题
1．总大肠菌群多管发酵法测定的复发酵试验，是每一管接种完同一发酵管的最典型菌落1～3个后，将发酵管置于____℃恒温箱中，培养____h，有产酸产气者，则证实有大肠菌群存在。

2．总大肠菌群多管发酵法测定的步骤分为__________、___________ 和____________。

3．总大肠菌群测定的滤膜灭菌是将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水后置于沸水浴中煮沸灭菌_____次，每次_____min，前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂；也可用121℃蒸汽灭菌10min。

二、判断题
总大肠菌群测定时，如果不能实现常规的检验步骤，例如水样运输途中不能保证所要求的温度，或采样后不能在允许的时间内进行检验等，都可采用延迟培养法。

( )
三、选择题
1．我国目前以______为总大肠菌群的报告单位，MPN值再乘______即为该体积水样中的总大肠菌群数。

( )
A． 100m1， 10 B． 1 L， 1 C， 1 L， 10
2．对受污染严重的水体，可选择________测定总大肠菌群。

( )
A．滤膜法 B. 多管发酵法 C．延迟培养法
3．我国目前总大肠菌群以________为报告单位。

( )
A．个/L B．个／ml C．个／100m1
四、问答题
1．简述多管发酵法测定水源水中总大肠菌群的初发酵操作步骤。

2．简述总大肠菌群革兰氏染色的操作步骤及主要注意事项。

可编辑修改精选全文完整版大肠菌群技术应知应会试题1、大肠菌群：在一定培养条件下能够（）、（）的需氧和兼性厌氧的革兰氏（）菌。

_________________________________2、VRBA平板计数范围：（）CFU，最低稀释度平板低于（）CFU的记录具体菌落数;_________________________________3、在大肠菌群检测第一法（）法中，如用到双料，则统一用（）进行空白对照；如果用的全部为单料，则统一用（）进行空白对照。

_________________________________4、大肠菌群作业SOP第一法引用的为（），第四法引用的为（）。

_________________________________5、检测过程中，十倍稀释时，手部不要触及（）位置。

_________________________________6、稀释度的选择应严格按照产品质量标准中的限量值进行选择，不得私自进行（）或（）。

_________________________________二、选择题（每题4分）_________________________________1、最可能数MPN是基于泊松分布的一种（D）方法。

A、计算B、计数C、直接计数D、间接计数(正确答案)2、大肠菌群主要来源于（）。

A、人的粪便B、人畜粪便(正确答案)C、粪便D、畜的粪便3、大肠菌群第一法适用于含量（）的食品中大肠的计数。

A、较低(正确答案)B、最低C、较高D、最高4、检样前，确认所检测样品匀液PH是否在（）之间A、6.8-7.8B、6.5-7.0C、6.5-7.5(正确答案)D、6.8-7.25、大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的（），带有或不带有沉淀环的菌落A、紫红色B、红色或紫色(正确答案)C、紫色D、红色6、培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加（）mlVRBA覆盖平板表面。

微生物实验基础知识考核试卷一、填空题（28分）1．总大肠菌群多管发酵法测定的复发酵试验，是每一管接种完同一发酵管的最典型菌落l～3个后，将发酵管置于℃恒温箱中，培养 h，有产酸产气者，则证实有大肠菌群存在。

①答案：37 242．总大肠菌群多管发酵法测定的步骤分为、和。

答案：初发酵试验平板分离复发酵试验3．总大肠菌群测定的滤膜灭菌是将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水后置于沸水浴中煮沸灭菌：次，每次 min，前两次煮沸后需更换水洗涤2～3次，以除去残留溶剂；也可用1 2 l℃蒸汽灭菌1 0min。

②答案：3 1 54. 细菌总数的菌落数在100以内按报告，大于100时采用两位有效数字，用表示，在报告菌落数为无法计数时，应注明水样的稀释度。

答案：实有数 10的指数6．用于细菌学检测的吸管上端要用填塞，并注意，使其快速、准确流出所用体积。

答案：普通棉花松紧适度7．测定水中细菌学指标的采样瓶口用牛皮纸等防潮纸包扎后，置于干燥箱中，于℃干热灭菌2 h，或用高压蒸汽灭菌器℃灭菌15 min；不能用加热方法灭菌的塑料瓶，应浸泡在O．5％过氧乙酸lO min或环氧乙烷气体进行低温灭菌；聚丙烯耐热塑料瓶，可用℃高压蒸汽灭菌器灭菌1 5 mina答案：1 60～1 70 12 1 12 18．测定自来水样中的细菌学指标时，采水前将水龙头开至最大，放水 min，然后关闭水龙头，用酒精灯火焰灼烧约 Inin消毒水龙头或用75％酒精溶液消毒水龙头，再打开水龙头、开足放水l min，以充分去除水管中的滞留杂质。

答案：3～5 3。

9．测定水样中细菌学指标时，从取样到检验不宜超过 h，否则应使用1 0℃以下冷藏设备保存样品，但不得超过。

答案：2 610．分层检测地表水中的细菌学指标时，应自而（方向）进行采样，以免不同层次的搅扰；与理化监测项目同时采样时，应先采集细菌学检验样品。

答案：上下11．配制好的用于细菌学检测的培养基，不宜保存过久，以少量勤配为宜。

利用多管发酵法检测水中大肠菌群数量作者：摘要：本实验利用多管法检测水中大肠菌群数量，以反映城市供水是否符合标准。

关键词：多管发酵法大肠杆菌最大可能数(MPN) 发酵试验平板分离前言：城市生活供水水质与人们生活息息相关，为确保饮水合用水安全，必须对其进行严格的常规监测。

但是水体中直接检测出病原微生物比较困难，因为它们数量极少，而且培养条件苛刻，分离鉴定比较困难。

因此常选用指示微生物作为水体中病原微生物数量的指标。

大肠菌在人体内和粪便中存在很多，受气污染的水体中较容易检测到大肠菌的存在，并且检测方法简单。

因此，常用大肠菌群为指标评价水的卫生质量。

1．原理：多管发酵法是根据大肠杆菌群细菌能发酵乳糖产酸产气及具备革兰氏染色阳性、无芽孢呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行实验，以求得水样中的总大肠菌群数，最大可能数（MPN）来表示实验结果。

2．实验2．1实验材料2．1．1 实验仪器：超净工作台、恒温培养箱、显微镜等。

2．1．2 培养基：乳糖蛋白胨培养基（分装于10支试管中，内涵倒置杜氏小管）、3倍浓度乳糖蛋白胨培养基（分装于5支试管中，内涵倒置杜氏小管）、伊红—美蓝（EMB）培养基。

（培养基均为灭过菌的）2．1．3染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥碘液、番红染色液。

2．1．4水样：拧开龙头流水5分钟后取自来水。

2．1．5其他：灭菌移液管、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。

2．2 实验步骤2．2．1初发酵试验：a 取5支装有3倍浓度乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积10ml；取5支装有乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积1ml；取5支装有乳糖蛋白胨无菌培养基的试管，标记水样名称和加水体积0.1ml。

b 用灭菌移液管分别吸取10ml水样加入到标记号的3倍浓度培养基试管中；分别吸取1ml水样加入到标记号的1倍浓度培养基试管中；分别吸取0.1ml水样加入到标记号的1倍浓度培养基试管中。

大肠菌群第二法计算题大肠菌群第二法，又称大肠杆菌群指数法，是一种评价水质卫生状况的重要方法。

它通过检测水样中大肠菌群的数量，来判断水质是否受到粪便污染，从而为水资源的合理利用和卫生管理提供科学依据。

一、大肠菌群第二法计算公式及意义大肠菌群第二法的计算公式为：大肠菌群指数（MI）=（A+B+C+D）/1000其中，A、B、C、D分别代表不同稀释度下的大肠菌群数量。

MI值越高，说明水体受到粪便污染的程度越严重。

我国《生活饮用水卫生标准》规定，MI值不应大于10。

需要注意的是，MI值并非绝对标准，还需结合其他水质指标综合评价水质状况。

二、计算实例与步骤详解以下是一个计算实例：某水样经稀释后，四个浓度下的大肠菌群数量分别为10、20、30、40。

则MI值的计算过程如下：MI = (10+20+30+40)/1000 = 10根据计算结果，该水样的MI值为10，处于正常范围内。

三、应用场景及注意事项大肠菌群第二法适用于水源水、饮用水、瓶装水等水样的检测。

在实际应用中，还需结合水样的其他污染指标，如细菌总数、总大肠菌群等，综合评价水质状况。

注意事项：1.水样采集要具有代表性，尽量避开污染源附近。

2.样品运输和保存过程中，应严格遵循相关标准和方法，防止样品污染或损失。

3.实验操作过程中，要确保实验器材和人员的卫生，避免实验误差。

4.计算MI值时，应注意单位的转换，确保计算结果的准确性。

总之，大肠菌群第二法作为一种评价水质卫生状况的方法，具有较强的实用性和可操作性。

通过对MI值的计算和分析，可以初步判断水体的污染程度，为水资源管理和保护提供依据。

1适用范围本标准适用于天然水和生活水中总大肠菌群的测定。

2方法概要总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37C 生长时能使乳糖发酵，在 24h 内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

总大肠菌群数系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。

本标准参照GB 5750-85制订。

3试剂和材料 3.1乳糖蛋白胨培养液：外购商品培养基或按下列方法自行配制。

3.1.1 组分蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g乳糖 氯化钠1.6 %溴甲酚紫乙醇溶液蒸馏水3.1.2 配制将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于 节pH为7.2〜7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置于高 压蒸汽灭菌器中，以 115C 灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。

3.2 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液: 按上述乳糖蛋白胨培养液（ 3.1 ）各组分的称量增加三倍配制。

3.3 品红亚硫酸钠培养基（供多吕发酵法用） :外购商品培养基或按卜列万法自行配制。

3.3.1组分蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾3.5g琼脂10〜30g蒸馏水1000ml无水亚硫酸钠5g 左右 5.0g 5.0g 1.0ml 1000ml1000ml 蒸馏水中加热溶解，用 1mol/L 的NaOH 或HCI 调332 贮备培养基的配制先将琼脂加至900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，用1mol/L的NaOH或HCI调节pH为7.2〜7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置于高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌20分钟，贮存于冷暗处备用。

3.3.3平皿培养基的配制将上法制备的贮备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。

再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10分钟以灭菌。

总大肠菌群,粪大肠菌群试卷(总2页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除一．填空题1.总大肠菌群多管发酵法测定的步骤分为____________、_____________和______________。

2.粪大肠菌群多管发酵法的初发酵试验，是将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，在____℃培养____h，产酸产气则为阳性。

二、判断题1.总大肠菌群测定时，如果不能实现常规的检验步骤，例如水样运输途中不能保证所要求的温度，或采样后不能在允许的时间内进行检验等，都可采用延迟培养法。

（）2.对受污染严重的水体样品，如果在初发酵中未发现产气，则应将其培养到48h，然后再进一步证实有无大肠菌类细菌。

( )3．如果粪大肠菌群测定的接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液10m1，如接种量为1m1，则接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10m1中。

( )4．粪大肠菌群多管发酵法的复发酵试验，是将培养物转接到EC培养液中，在35℃下培养24h。

( )5．水中总大肠菌群和粪大肠杆菌的快速测定法，适用于医院污水、生活污水、垃圾渗滤液以及其他行业(如餐饮业、食品加工等)排入地表水中的污水。

( )三、选择题1．我国目前以为总大肠菌群的报告单位，MPN值再乘即为该体积水样中的总大肠菌群数。

( )A． 100m1， 10 B． 1 L， 1 C， 1 L， 10四．简答题1.简述多管发酵法测定水源水中总大肠菌群的初发酵操作步骤。

2.如果总大肠菌群和粪大肠菌群测定水样接种量不是10ml、1m1和0.1ml而是较低或较高三个浓度的水样，应如何计算总大肠菌群数或粪大肠菌群数?试写出计算公式。

答案一．1.初发酵试验 平板分离 复发酵试验2. 37 24二．1.正确2.正确3.错误4.错误5.正确三.1.C四. 1.答案：(1)将水样做1∶10稀释。

实验十一(综合实验）多管发酵法测定水中大肠菌群一、实验目的1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。

2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。

二、实验原理发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法1) 初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经37 ºC培养24 h，观察产酸产气情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，以初步判断是否有大肠菌群存在。

2）平皿分离（证实试验）⏹水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。

⏹将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37 ºC培养24 h，根据菌落特征（带核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。

3）复发酵试验(完成实验）⏹将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37 ºC培养24 h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。

⏹产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；⏹根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。

三、实验材料1、培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。

2、仪器或其他用具：载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。

四、操作步骤1．水样的采取实验室提供水样2．河水的检查（1）初（步）发酵实验水样的稀释：10-1与10-2接种：分别吸取1ml 10-2 、10-1和原水样接入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管；另取10ml原水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管，混匀后，37 ℃培养24 h，24 h未产气的继续培养48 h。

（2）平板分离将经24 h和48 h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 ℃培养18～24 h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。

多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群摘要：总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的在37℃生长时能使乳糖发酵、在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌。

总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。

在日常的检测过程中，特别是在饮用水的检测中，总大肠菌群的检测对检测环境、检测人员的操作水平和经验要求都很高，且检测时间长达三天，因此其检测结果的准确率都和那提高。

笔者在长期检测中对一些检测过程中出现的问题着重进行了归纳，通过反复的试验，和仔细观察后，摸索出了一些规律和方法，在此加以总结，有助于以提高总大肠菌群检测的高效性和准确性。

关键词：饮用水、总大肠菌群、多管发酵根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。

在检测时可用多管发酵法，以100mL水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示的。

不同的方法标准略有差异，但检测步骤大体相同，即：乳糖发酵实验、分离培养和证实试验。

按《生活饮用水标准检验方法》微生物指标GB5750.12-2006的规定，总大肠菌群检测的步骤为：2.1.5.1乳糖发酵实验（初发酵）；2.1.5.2分离培养；2.1.5.3证实实验（复发酵）。

而检测的难点主要在于步骤2.1.5.1、2.1.5.3中“产酸产气”的确认及步骤2.1.5.2中的菌落形态及染色的确认。

初发酵阳性管，不能肯定就是总大肠菌群，经过证实试验后，有时可能成为阴性。

经过多次观察发现在复发酵成阳性的样品，在初发酵时都有着一些共同的现象。

在此，我们从曾经受过微生物污染水样中选出两个最具代表性的样品（污染1＃污染2＃）为例，加以说明。

1、乳糖发酵实验中产酸与产气的判断：分别取10ml水样接种到5只10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，置于36℃±1℃的培养箱内培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则报告总大肠菌群阴性，如产酸产气则进行下一步实验。

实验三多管发酵法检测水中的大肠菌群（一）实验目的1. 了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义2．学习检测水中大肠菌群的方法（二）实验原理大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。

大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌（Escherichia coli）为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。

我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。

多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。

乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。

1．初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。

48小时后仍不产气的为阴性结果。

2．平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo′s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar,EMB agar）平板上划线分离菌落。

3．复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。

原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

（二）实验器材1.水样自来水2．试剂乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝或复红亚硫酸钠琼脂平板，革兰氏染液。

3．仪器及其它用品载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管，革兰氏染液，显微镜，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，灭菌三角瓶等。

（四）实验方法1．水样的采取水源水2．初发酵试验取16支发酵管，其中10支用移液管加入10ml一倍的乳酸蛋白胨培养液，5支加入5ml 三倍乳糖蛋白胨培养液，1支加入9ml自然水。

水中总大肠菌群的测定—多管发酵法一．原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。

多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。

试验结果以最可能数(most probable numbe),简称MPN 表示。

三．仪器(1) 高压蒸气灭菌器。

(2) 恒温培养箱、冰箱。

(3) 生物显微镜、载玻片。

(4) 酒精灯、3mm 接种环。

(5) 培养皿(直径100mm)、试管(5 x150mm),吸管(1、5、10mL)、烧杯(200、500、2000mL)、锥形瓶(500、1000mL )、采样瓶、移液枪。

四．培养基及染色剂的制备1. 乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉膏、5g乳糖和5g 氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节溶液pH为7.2〜7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀，分装于试管中，于121C 高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。

2. 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。

除蒸馏水外,各组份用量增加至三倍。

3．伊红美蓝培养基：①贮备培养基的制备：于2000mL烧杯中，先将20g琼脂加到900mL 蒸馏水中，加热溶解。

再加 2.0g 邻酸二氢钾及10g 蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至1000mL,调节溶液pH值为7.2〜7.4。

趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入10g 乳糖，混匀后定量分装于250mL或500mL锥形瓶内，于121C高压灭菌15min,贮于冷暗处备用。

②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。

根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的2% 伊红水溶液（0.4g 伊红溶于20mL 水中）和一定量已灭菌的0.5%美蓝水溶液（0.065g 美蓝溶于13mL 水中），加入已融化的贮备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此培养基适量倾入已灭菌的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。