9 菌落PCR鉴定

菌液PCR的经验已有578 次阅读 2013-6-19 11:27 |系统分类:科研笔记由于课题组所需，我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献，和导师商量，导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样：假阳性。

我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落，运用目的基因的上下游引物做PCR，出来条带的有有52个。

按照经验选取比较亮的14个提取质粒，酶切和PCR双鉴定。

结果仅有一个为阳性克隆，其余均为假阳性（假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段）。

也难怪老板一口回绝，只是我需要做的基因太多，最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提，累死人不偿命。

后来我自己对着图谱研究了一下（我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体）.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物，则1.P出大小约150bp的片段，则为MCS序列，无插入片段2,若有插入片段，则应该为目的大小+152bp如下图所示：后再改进为T7+目的基因下游引物（目的基因-R），或者目的基因上游引物（目的基因-F)+SP6，因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图：总结如下：1.PCR引物的选择（此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R 或SP6+目的基因-FpCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-RpEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中，37°C 200rpm摇床摇2-4小时以上（通常赶时间的话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）3.菌液的处理无需特殊处理菌液或取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸4.pcr体系：无特殊要求同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度5.模板的量：1-2ul未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）6.退火温度：55-58°C此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C 或者58°C完成T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P 出目的条带7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步以上就是学弟的一点个人经验，绝大部分经过自己的验证，如有觉得不妥的地方还请大家多多指正！再次高呼：菌液PCR在阳性克隆的筛选中异常的方便和廉价，高度推崇！！！P.S. 通过长时间的魔鬼试验进程，我现在基本可以做到用肉眼高精度的识别菌落，一般挑取的菌落90%以上均为阳性菌落，所以这篇文章暂时定位于小鸟级别的分生试验者，老鸟。

菌落PCR鉴定(载体上的通用引物)
（一）菌落的挑取及PCR扩增体系的配制
1.将隔天在生化培养箱过夜培养的平板拿出来，准备好已经灭好菌的经过烘箱烘干的8连管，在超净台中，在每个管中加入20-30μl的SOC培养基，用牙签或者10uL的枪头在每个板中挑出标记好单菌，收拾好超净台。

2.放入200rpm，37度的摇床，摇30-60min。

3.PCR菌落鉴定体系（20ul)
2×Power Tap Master Mix酶
引物(TP-SR\TP-SF)
ddH
2O
（灭菌）
菌液
10
1/1
6
2
ul
ul
ul
总体积20 ul
（注：2×Power Tap PCR Master Mix 酶，品牌Bioteke Gorporation; Lot ＃0020140918 1ml ；Storage:-20℃）
（二）菌液PCR
PCR程序
94℃5min
94℃30s
58℃30s
72℃30s
72℃5min
4℃∞
30x
（三）电泳
全部上样跑电泳并记下上样顺序，（120V、260mA、30min）核酸染料染色15-20分钟，凝胶成像仪拍照。

③ 64e C 退火30 cycles实验六菌落的PCR鉴定【实验目的】通过本实验学习菌落PCR的基本原理与实验技术。

【实验原理】重组子经过蓝白斑筛选后（具有假阳性），接下来可通过菌落PCR 方法对重组子进一步进行快速鉴定。

以重组质粒作为PCR扩增模板。

釆用外源基因特异性引物进行扩增，如果重组质粒转化入宿主细胞，则可以扩增得到预期大小的目的片段。

【实验步骤】用200 PL的黄色枪头挑取转化平板上白色的单菌落于15 PL无菌水中,吹打混匀，从中取2UL菌液作为菌落PCR模板。

1.在200 Pl PCR管内配制20 Ml反应体系:反应物体积/订模板DNA 2.0火菌蒸谓水（ddH20）10.310 X PCR缓冲液 2.0dNTP (2.5mM) 1.6引物1(2uM) 2.0引物2(2uM) 2.0rTaq 酶（1.0单位）0.1Total202.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。

加样后用手轻弹混匀,6, 000 rpm 离心15 sec 使反应成分集于管底。

3. PCR反应热循环程序设置:①94 °C预变性3 min;②94 9变性30 sec;④72 °C延伸1 min;⑤72 9延伸3 min;⑥ 16#Cpause反应结束后短暂离心，置4C保存备用。

配制1 %的琼脂糖凝胶。

4•取5 u L PCR产物加1 u L 6 X loading buffer于1%的琼脂糖凝进行电泳剩余的13 PL 菌液置4・C保存备用。

【结果与分析】由图可知，1、4泳逍没有条带，说明目的基因没转入感受态细胞。

可能的原因是连接体系有外源性核酸酶污染，使T-载体变为平端，连接后由于移码，而生成白斑。

而2、3号泳道目的基因己成功转入感受态细胞中，所得片段大小符合目的片段。

取10ul ddH2O至1.5ml的EP管，用灭菌牙签挑单菌落至其中，分散均匀，顺便用牙签转接至新平板做标记后培养，取菌落稀释液1ul到薄壁管，加入预混PCR溶液9ul，进行PCR 验证。

加100ul LB（含相应抗生素如氨苄青霉素）至菌落稀释的1.5ml EP管，然后拿去培养，EP管可以固定在漂浮板或者放在EP管架上用纸包好。

培养好的菌液离心倒去上清液，用残留的液体分散菌体沉淀，加入30ul的破菌电泳缓冲液（SDS 0.5%,Tris-HCl 0.04mol/L,EDTA 0.002mol/L,蔗糖 0.4mol/L，溴酚蓝 0.02％，NaOH 0.1mol/L），50-70度C 水浴15min，12000r/p 离心15min，取上清液30ul电泳，染色后观察，也可以使用前先把染料加入到破菌电泳缓冲液中，比例是一般电泳1/4，如果感觉多了再减少。