LB培养基中所用抗生素终浓度

①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22卩山滤器过滤除菌；
②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；
③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。

注意：镁离子是四环素的拮抗剂。

对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB 培养基。

下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度
氨苄青霉素：贮液浓度50 mg/ml溶于水-20 C保存工作浓度20卩g/ml （严紧型质粒）60卩g/ml （松弛型质粒）
羧苄青霉素：贮液浓度50 mg/ml溶于水-20 C保存工作浓度20卩g/ml （严紧型质粒）60卩g/ml （松弛型质粒）
氯霉素：贮液浓度34 mg/ml溶于乙醇-20 C保存工作浓度25
卩g/ml （严紧型质粒）170卩g/ml （松弛型质粒）
卡那霉素：贮液浓度10 mg/ml溶于水-20 C保存工作浓度10
卩g/ml （严紧型质粒）50卩g/ml （松弛型质粒）
链霉素：贮液浓度50 mg/ml溶于水-20 C保存工作浓度10
卩g/ml （严紧型质粒）50卩g/ml （松弛型质粒）
四环素：贮液浓度5 mg/ml溶于乙醇-20 C保存工作浓度10
卩g/ml （严紧型质粒）50卩g/ml （松弛型质粒）质粒类型：。

L B培养基怎样配制 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】L B培养基怎样配制LB一般被解释为Luria-Bertani，然而根据其发明人贝尔塔尼(GiuseppeBertani)的说法，这个名字来源于英语lysogenybroth，即溶菌肉汤。

LB培养基是近年来用于培养基因工程受体菌(大肠杆菌)的常用培养基之一。

LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称普通培养基，含有酵母提取物、胰化蛋白胨和NaCl。

酵母提取物：酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的淡黄色粉末，其中氨基酸含量30%以上，总蛋白50%以上，核苷酸10%以上，广泛用作生物培养基和食品调味品制造原料。

胰化蛋白胨：一种优质蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化，浓缩干燥而成的白色粉末，含有丰富的氮源、氨基酸等。

酵母提取物为微生物提供碳源、能源、磷酸盐、生长因子、维生素等;蛋白胨主要提供氮源;NaCl主要提供微生物生长环境(如渗透压)，其次是提供无机盐。

在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。

琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或垫以石棉网直接煮沸溶化。

琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。

固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。

LB培养基配方(每升)酵母提取物5g胰化蛋白胨10g氯化钠10gNaOH调pH至，121℃、20min高压灭菌。

LB固体培养基LB培养基1L琼脂粉15gNaOH调pH至，121℃、20min高压灭菌。

有时需在培养基中添加抗生素，琼脂凝固点为40℃，所以添加抗生素最好在50～55℃。

LB培养基用途：用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。

LB培养基怎样配制之马矢奏春创作LB一般被解释为Luria-Bertani, 然而根据其发明人贝尔塔尼(Giuseppe Bertani)的说法, 这个名字来源于英语lysogeny broth, 即溶菌肉汤.LB培养基是近年来用于培养基因工程受体菌(年夜肠杆菌)的经常使用培养基之一.LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基, 有时又称普通培养基, 含有酵母提取物、胰化卵白胨和NaCl.酵母提取物：酵母经破壁后将其中卵白质、核酸、维生素等抽提, 再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成份的淡黄色粉末, 其中氨基酸含量30%以上, 总卵白50%以上, 核苷酸10%以上, 广泛用作生物培养基和食品调味品制造原料.胰化卵白胨：一种优质卵白胨, 是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化, 浓缩干燥而成的白色粉末, 含有丰富的氮源、氨基酸等.酵母提取物为微生物提供碳源、能源、磷酸盐、生长因子、维生素等;卵白胨主要提供氮源;NaCl主要提供微生物生长环境(如渗透压), 其次是提供无机盐.在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂.琼脂在经常使用浓度下96℃时溶化, 一般实际应用时在沸水浴中或垫以石棉网直接煮沸溶化.琼脂在40℃时凝固, 通常不被微生物分解利用.固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的分歧而有所分歧.由于这种培养基多用于培养细菌, 因此, 要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性, 以利于细菌的生长繁殖.LB培养基配方(每升)酵母提取物 5g胰化卵白胨 10g氯化钠 10gNaOH调pH至7.0, 121℃、20min高压灭菌.LB固体培养基LB培养基 1L琼脂粉 15gNaOH调pH至7.0, 121℃、20min高压灭菌.有时需在培养基中添加抗生素, 琼脂凝固点为40℃, 所以添加抗生素最好在50～55℃.LB培养基用途：用于一般细菌培养, 特别用于分子生物学试验中年夜肠杆菌的保管和培养.LB培养基使用原理：卵白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子;氯化钠维持均衡的渗透压;葡萄糖提供碳源;琼脂是培养基的凝固剂.LB培养基配制方法配制每升培养基, 应该在950 ml去液态lb培养基离子水中加入：胰化卵白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.2.抗生素的加入：高压灭菌后, 将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中, 待培养基温度降到55℃时(手可触摸)加入抗生素, 以免温渡过高招致抗生素失效, 并充沛摇匀.3.倒板：一般10ml倒1个板子.培养基倒入培养皿后, 翻开盖子, 在紫外下照10-15分钟.4.保管：用封口胶封边, 并颠倒放于4℃保管, 一个月内使用. 配400ml的话成份按比例减少就行了, pH还是要按规定的.。

质粒转染实验步骤质粒转染大肠杆菌材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1. LB 培养基的配制：在950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH 调pH 至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi 高压下蒸汽灭菌20min. 固态培养基LB 固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlLB 培养基加入1.5g 琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB 固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50 g/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般10ml 倒1 个板子。

培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。

2. 从-70℃冰箱中取200 l 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

3. 加入质粒DNA 溶液（含量不超过50ng，体积不超过10 l），轻轻摇匀，冰上放置30分钟后。

4. 42℃水浴中热击45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟。

5. 向管中加入1ml LB 液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1 小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。

6. 将上述菌液摇匀后取100 l 涂布于含Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24 小时。

同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，其它操作与上面相同。

此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。

细菌培养常用培养基和抗生素的配制方法、常用培养基1、LB 培养基将下列组分溶解在0.9L 水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g如果需要用INNaOH （〜1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。

注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。

2 、SOB 培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨20g酵母提取物5g氯化钠0.5g1mol/L 氯化钾2.5ml用水补足体积到1L。

分成100ml的小份，高压灭菌。

培养基冷却到室温后，再在每100ml 的小份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁。

3、SOC培养基成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁外，再加2ml 灭菌的1mol/L 葡萄糖（18g 葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。

4 、TB 培养基将下列组分溶解在0.9L水中:蛋白胨12g酵母提取物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。

冷却到60 C , 再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4/0.72mol/LK2HPO4 的溶液（2.31g 的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。

高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。

5、2X Y培养基将下列组分溶解在0.9L水中:蛋白胨16g酵母提取物10g氯化钠4ml如果需要用INNaOH (〜1ml )调整pH 至7.0，再补足水至1L 。

注：琼脂平板需添加琼脂粉 12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉 7g/L 。

6、YPD 培 养基将下列组分溶解在 0.9L 水中： 蛋白胨 20g 酵母提取物 10g 葡萄糖 20g用水补足体积为 1L 后，高压灭菌。

建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基 添加1.6g 色氨酸，因为 YPD 培养基是色氨酸限制型培养基。

普通使用的抗生素的贮液和工作液浓度下面的内容摘自《分子克隆》第三版附录2①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22 μm滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。

注意：镁离子是四环素的拮抗剂。

对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB培养基。

下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度氨苄青霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 20 μg/ml （严紧型质粒） 60 μg/ml （松弛型质粒）羧苄青霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 20 μg/ml （严紧型质粒） 60 μg/ml （松弛型质粒）氯霉素贮液浓度 34 mg/ml 溶于乙醇 -20℃保存工作浓度 25 μg/ml （严紧型质粒） 170 μg/ml （松弛型质粒）卡那霉素贮液浓度 10 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）链霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）四环素贮液浓度 5 mg/ml 溶于乙醇 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）利福平，Rifampicin (INN) 简写为Rif。

分子式：C43H58N4O12，相对分子质量为822.94022 [g/mol]。

化学名 3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]-利福霉素利福平是一种半人工合成的抗生素，最初从地中海氏拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis mediterranei）中获得。

利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性。

该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（包括麻风分枝杆菌等）在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。

常用培养基和抗生素的配制方法1.LB培养基：材料：10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、水至1000mL。

方法：将蛋白胨、酵母提取物和氯化钠加入水中，调整pH值至7.0，用自动出厂级水蒸馏水冲洗到1000mL。

2.M9盐基培养基：材料：64gNa2HPO4•7H2O、15gKH2PO4、2.5gNaCl、5gNH4Cl、水至1000mL。

方法：将Na2HPO4•7H2O、KH2PO4、NaCl和NH4Cl加入水中，调整pH值至7.0，用自动出厂级水蒸馏水冲洗到1000mL。

3.TSB培养基：材料：17g磷酸二氢钾、20g蛋白胨、5g氯化钠、水至1000mL。

方法：将磷酸二氢钾、蛋白胨和氯化钠加入水中，调整pH值至7.3，用自动出厂级水蒸馏水冲洗到1000mL。

4.青霉素琼脂培养基：材料：5g酵母提取物、1g酪蛋白、10gD-葡萄糖、2gK2HPO4、2gKH2PO4、20g琼脂、水至1000mL。

方法：将酵母提取物、酪蛋白、D-葡萄糖、K2HPO4和KH2PO4加入水中，调整pH值至7.0，加入琼脂，用自动出厂级水蒸馏水冲洗到1000mL。

抗生素的配制方法：1.青霉素盐酸盐溶液：材料：10g青霉素盐酸盐、水至100mL。

方法：将青霉素盐酸盐加入水中，搅拌至溶解。

2.氨苄青霉素钠盐溶液：材料：10g氨苄青霉素钠盐、水至100mL。

方法：将氨苄青霉素钠盐加入水中，搅拌至溶解。

3.克拉霉素溶液：材料：10g克拉霉素、水至100mL。

方法：将克拉霉素加入水中，搅拌至溶解。

4.挠敏霉素溶液：材料：10g挠敏霉素、水至100mL。

方法：将挠敏霉素加入水中，搅拌至溶解。

5.氯霉素溶液：材料：10g氯霉素、水至100mL。

方法：将氯霉素加入水中，搅拌至溶解。

以上是常用培养基和抗生素的基本配制方法，具体使用时还需要根据实验的需求和文献资料进行相应的优化和调整。

在配制过程中，需要注意配制环境的无菌操作、避免污染和准确称量材料的重量等。

实验一LB培养基的配制和大肠杆菌的培养第一部分理论知识一．生物工程所需的微生物学原理基因工程主要采用革兰氏阴性细菌作为宿主细胞表达系统。

下面着重讲述大肠杆菌。

1.大肠杆菌的一般特性大肠杆菌（Escherichia coli，简写为E.coli）属于革兰氏阴性细菌，大肠杆菌不仅能液体培养，也能在固体培养基上很好地生长。

在细菌培养过程中，有两方面的因素影响它的纯度：1.其它细菌造成的细菌污染。

因此，用于培养的所有药品、器皿必须消毒，全部过程应在无菌条件下操作；2.遗传的异质性。

遗传上的异质性发生在培养过程中原有细菌株系遗传成分的变异，导致原有标记性状的改变。

其原因可能是天然突变的结果；或是在由质粒携带标记性状的情况下，异质性可能来自细胞分裂过程中质粒的丢失或质粒的分离。

据目前所知，许多质粒以相当高的频率在寄主细胞分裂时发生分离，从而引起所带性状的变化。

2. 抗生素抗性抗生素阻止细菌生长往往有抑菌和杀菌两种方式。

抑菌就是指药物仅仅使细菌生长受阻而未直接引起细胞死亡；而杀菌是指药物引起细胞裂解或死亡。

一种抗生素抑菌或杀菌效果取决于细菌接触药物的条件。

例如，大肠杆菌接触低水平的四环素将会通过四环素与核糖体结合，影响细菌蛋白质的合成而最终抑制细胞生长。

然而，结合着四环素的核糖体是可恢复的，因为受抑制的细胞被稀释到无药物的培养基上，将会重新恢复正常细胞的生长。

这种抑制的可恢复性表明四环素正以抑菌的方式发挥功能。

当四环素浓度加大，阻止细菌声中的另一种方式变得明显而不可逆，亦即在高浓度下，四环素以杀菌方式发挥功能。

细菌有三种抗生素抗性的机制：（1）抗生素在细菌中作用的目标位置发生了变化。

例如蛋白质合成抑制剂链霉素的抗性通常是由于细菌合成了一种变化了的核糖体蛋白质，这种蛋白质不再与链霉素相连，因此阻止了链霉素的抑制行为；（2）组织药物进入细胞。

如对四环素的抗性是由于细菌合成了阻止四环素进入细胞的膜蛋白，因而四环素的穿透性大为减低所致；（3）改变或钝化药物。