蔗糖合成酶(分解方向;SS-I)活性检测试剂盒说明书 微量法

一、目的了解植物组织中提取蔗糖酶的方法，掌握蔗糖酶活力测定的原理。

二、原理本实验以Nelson 方法测定酶活力，其原理是：蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖作为还原糖含有的自由醛基，在碱性溶液中将Cu 2+ 还原，还原糖本身被氧化成羟酸；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物（砷钼蓝），在510nm 波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的活力，该法测定的范围为25~200μg。

三、主要仪器及试剂四、操作步骤1．标准曲线制作（1）取9 个具塞试管，按表1 加样：（2）向每管中加1mL Nelson 试剂，盖上塞子，置沸水浴中20 min。

冷至室温，向每管中加1 mL 砷钼酸试剂。

（3）5 min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，混匀。

（4）在510 nm 下测定光密度，以还原糖葡萄糖为横坐标，以OD510nm 值为纵坐标，制作标准曲线。

2．酶活力测定取2g 小麦苗，加入2mL 乙酸缓冲液，在冰浴中用研钵研磨成糊状，12 000r/min 离心10min，留取上清液用于酶活测定。

取2 支具塞刻度试管，向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml，0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL，适当稀释的酶液1mL，以同样处理但不加酶液者为空白对照，室温下放置10min。

然后向每管中加1mL Nelson 试剂，置沸水浴中20min。

冷却至室温，向每管中加1mL 砷钼酸试剂，5min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，510 nm 下比色，测定光密度OD510nm。

五、实验结果活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定义为酶的1 个活力单位（U）酶活力的影响教师：XXX实验类型：基础学时：10(参考)内容：一、实验目的初步掌握用正交表设计实验方案并用数理统计方法处理实验数据的步骤和注意事项。

二、实验原理酶的催化作用受多种因素的影响。

欲求某因素对酶活力的影响，通常是固定其它因素，测定该因素不同水平下的酶活力。

蔗糖合成酶（SS）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号:BC0585规格:100T/48S产品内容：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存；试剂二：粉剂10mg×1支，4℃保存，临用前加1mL水，配制成10mg/mL蔗糖溶液，再将其用蒸馏水稀释为500μg/mL备用；试剂三：液体2mL×1瓶，4℃保存；试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存；试剂五：液体6mL×1瓶，4℃保存。

产品说明：蔗糖是源（叶片等）光合产物向“库”器官运输的主要形态。

SS（EC 2.4.1.13）催化植物体内游离果糖和葡萄糖合成蔗糖。

SS催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖，蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰操作步骤：一、测定样品提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。

8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定操作表：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）：试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管样本1010蒸馏水454555试剂一45试剂二10混匀，25℃准确水浴10min试剂三15151515沸水浴中煮沸10min左右（盖紧，以防止水分散失），冷却试剂四210210210210试剂五60606060混匀，80℃水浴保温20min，冷却后，在480nm下测定各管吸光值。

标准管和空白管只做一管。

每个测定管需要设定一个对照管。

蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号:BC4310规格:50T/24S产品内容：提取液：液体30mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体8mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。

临用前加入2.5mL试剂一充分溶解待用，用不完的试剂建议分装后，-20℃保存，避免反复冻融。

试剂三：液体8mL×1瓶，4℃避光保存。

标准品：粉剂×1支，20mg果糖；4℃保存。

临用前加入1mL蒸馏水溶解，配成20mg/mL果糖溶液备用。

4℃保存一周。

产品简介：蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代谢过程的关键酶，负责催化蔗糖分解与合成的可逆反应，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG与果糖，参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。

分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖与UDPG，果糖与3,5-二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得SS-I活性。

试验中所需的仪器和试剂：可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：一、粗酶液提取：组织：按照质量（g）:提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，8000g，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、将20mg/mL标准液用蒸馏水稀释为5、4、3、2、1mg/mL的标准溶液备用。

3、操作表：(在1.5mL离心管中操作)试剂名称（µL）对照管测定管标准管空白管样本2020--标准溶液--20-蒸馏水---20试剂一808080试剂二-80--混匀，30℃水浴30min后，95℃水浴10min（盖紧，防止水分散失）。

蔗糖合成酶的测定方法[方案]蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L，pH7.5)缓冲液，包括50mmol/L MgCI;2mmol/LEDTA;20.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%间苯二酚:称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉)，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。

2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液，50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20μL 50 mmol/LMgCI， 220μL 100mmol/L UDPG，20μL 100mmol/L6-磷酸果糖(20μL 100mmol/L果糖)， 30?中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80?水浴保温10min，冷却后置于480nm 处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作:取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算,1,1样品中酶活性(μg?g?h)=式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量(μg);V—提取酶液时加入的缓冲液体积(ml); 1V—酶反应时加入的粗酶液体积(ml) 2淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液:0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制;标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol?L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。

土壤蔗糖酶(S-SC）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号：BC0245规格：100T/48S产品说明：S-SC能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收，其酶促作用产物与土壤中有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度密切关，是评价土壤肥力的重要指标。

S-SC催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm 有特征光吸收，在一定范围内540nm光吸收增加速率与S-SC活性成正比。

自备用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量比色皿/96孔板、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。

产品内容：试剂一：甲苯1mL×1瓶，4℃保存；（自备）试剂二：液体7.5mL×1瓶，4℃保存；试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前每瓶加入22mL双蒸水充分溶解备用；试剂四：液体30mL×1瓶，4℃保存；标准品：粉剂×1支，4℃保存，含10mg无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入1mL蒸馏水溶解备用，4℃可保存1周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。

标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg/mL。

操作步骤：1.分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2.测定步骤和加样表：第1页，共2页试剂名称测定管对照管标准管空白管风干土样（g）0.030.03--试剂一（μL）55--振荡混匀，使土样全部湿润，37℃水浴15min试剂二（μL）7575--试剂三（μL）220--双蒸水（μL）220--混匀，放入37℃水浴培养24小时，10000g，4℃，离心5min，取上清液，将培养结束的上清液稀释10倍（取0.1mL上清液，加入0.9mL蒸馏水）若后续测定吸光值仍大于1.5继续稀释。

上清液（μL）8585标准品（μL）85蒸馏水（μL）85试剂四（μL）215215215215充分混匀，放入沸水浴中煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀。

蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性检测试剂盒说明书微量法货号:UPLC-MS-4147规格:100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一液体8mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶-20℃保存试剂三液体8mL×1瓶4℃保存标准品粉剂×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前加入2.5mL试剂一充分溶解待用，用不完的试剂建议分装后，-20℃保存，避免反复冻融；2、标准品：20mg果糖，临用前加入1mL蒸馏水溶解，配成20mg/mL果糖溶液备用，4℃保存一周。

产品说明：蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代谢过程的关键酶，负责催化蔗糖分解与合成的可逆反应，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG与果糖，参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。

分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖与UDPG，果糖与3,5–二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得SS-I活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）组织：按照质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，8000g，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、将20mg/mL标准液用蒸馏水稀释为8、6、5、4、3、2、1mg/mL的标准溶液备用。

转化酶和蔗糖合成酶活性的测定方法2 Oct, 2013一、酶的提取：1、组织样品（3 ovary of 0 dap或0.1g叶片）在液氮中磨碎，加入0.6 mL（或1.5 mL）酶提取液，匀浆转入2mL离心管中，用100 uL提取液洗研钵。

每管加入6或15 μL PMSF（100mM）和3或7.5 μL DTT（1M）。

2、14000 g（约12000rpm）离心10 min，取上清液。

3、沉淀用0.5mL提取缓冲液重新悬浮，14000 g离心3 min，弃上清液。

4、沉淀用0.6或1.5 mL提取缓冲液悬浮。

二、酶活性的测定：（一）不溶性酸性转化酶活性的测定：细胞壁转化酶1、取40 μL酶提取液（上清或沉淀悬浮液）加入360 μL酸性转化酶分析液中，30℃水浴保温1 h。

2、加入60 μL 1 M Tris-HCl （pH8.0）进行碱化处理。

3、85℃保温3 min，然后加入等体积（460 μL）氯仿，混匀，14000 g离心5 min，4、取上清140 μL加入380 μL葡萄糖测定液，30℃水浴保温30 min。

5、测定OD340nm，然后根据葡萄糖标准曲线计算出转化酶的活性，表示为mg Gluh-1 g-1 FW。

注：每个测定样品均做一个对照，对照除省略第1步中30℃水浴保温1 h外，其他相同。

（二）可溶性酸性转化酶活性的测定：液泡转化酶1、取40 μL酶提取液（上清或沉淀悬浮液）加入360 μL酸性转化酶分析液中，30℃水浴保温1 h。

2、加入60 μL 1 M Tris-HCl （pH8.0）进行碱化处理。

3、85℃保温3 min，然后加入等体积（460 μL）氯仿，混匀，14000 g离心5 min，4、取上清140 μL加入380 μL葡萄糖测定液（由葡萄糖分析液配制），30℃水浴保温30 min。

5、测定OD340nm，然后根据葡萄糖标准曲线计算出转化酶的活性，表示为mg Gluh-1 g-1 FW。

蔗糖是重要的光合产物，是植物体内运输的主要物质，优势碳水化合物的暂贮形式之一。

蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内催化蔗糖合成的两种酶。

对这两种酶活性的测定，可以了解植物组织合成蔗糖能力的高低。

【实验原理】蔗糖合成酶催化游离果糖与葡萄糖工体UDPG反应生成蔗糖。

UDPG+果糖---蔗糖+UDP这是一个可逆反应，平衡常数为1.3-2.0。

该酶在分解方向的Km值相对较高（30-150mmol/L），细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行。

蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定（外加底物UDPG和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性），也可以在分解方向进行测定（外加蔗糖和UPD，测定果糖含量表示酶活性）。

蔗糖磷酸合成酶（SPS）催化UDPG与果糖-6-磷酸（F6P）结合形成磷酸蔗糖：UPDG+F6P---蔗糖-6-P+UDP+H+6-磷酸蔗糖可以经磷酸蔗糖酶（SPP）水解后形成蔗糖。

实际上最近有证据证明SPS 和SPP可以在体内形成一个复合体，因此使得SPS催化的反应基本上是不可逆的。

酶活性测定是外加UDPG和F6P，测定产物蔗糖的量表示酶活性。

一般把SPS-SPP系统看作是蔗糖合成的主要途径，而把蔗糖合成酶看作是催化蔗糖分解的。

果糖是酮糖，可与间苯二酚混合加热反应生成红色产物，在一定范围内糖的含量与反应液颜色成正比。

蔗糖在含有盐酸的间苯二酚中水解成葡萄糖和果糖，也能生成红色产物，在480nm处可比色测定。

【实验材料】植物茎【仪器设备及设备】冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平（感量0.01mg），0.1、0.5、1、5ml移液管各1个，10ml具塞试管10支，5ml量瓶一个，冰箱【试剂药品】1.提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl(PH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl 2,2mmol/LEDTA-Na 2,2%乙二醇，0.2%牛血清蛋白（BSP），2%PVP，5mmol/LDTT。

植物蔗糖合成酶(SS)试剂盒说明书试验原理：植物蔗糖合成酶(SS)试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。

先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。

洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。

再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。

产生颜色。

颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

内容及其配制自备材料1）蒸馏水。

2）加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3）振荡器及磁力搅拌器等。

安全性1）避免直接接触终止液和底物A、B。

一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2）实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3）不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

作注意事项1）试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。

稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

2）实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3）不用的其它试剂应包装好或盖好。

不同批号的试剂不要混用。

保质前使用。

4）使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5）使用干净的塑料容器配置洗涤液。

使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6）洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7）底物A应挥发，避免长时间打开盖子。

底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

避免用手接触，有毒。

实验完成后应立即读取OD值。

8）加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

9）按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法1）血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。

使用不含热原和内毒素的试管。

收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2）血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。

1000×g离心30分钟去除颗粒。

1．2．1蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性参照於新建[]的方法并稍加改进。

酶液提取：取0.5g左右预冷的水稻叶片(剪碎的去主叶脉的叶片)，加4 mL缓冲液A(50mmol ／L Tris—HC1，pH 7．0、10 mmol／L MgC12、2 mmol／L EDTA-Na2、20 mmol／L巯基乙醇、2％乙二醇)于预冷的研钵中冰浴快速研磨成糊状，倒入离心管中，在低温冷冻离心机上4℃ 10000 r／rmin离心30 min，所得上清液用于酶活性测定。

SS活性的测定：在总体积0.15 mL的反应介质(含50 mmol／L Tris—HCL，pH7.0、10 mmol ／L MgC12, 10 mmol／L果糖、3 mmol／L UDPG)中，加入100uL酶液，30℃水浴中反应10 min，加入2 mol／L NaOH 0.05mL，沸水煮10 min，流水冷却。

再加入1．5 mL浓盐酸和0．5 mL 0．1％的间苯二酚，摇匀后置于80℃水浴保温10 min，冷却后于480nm处比色测定蔗糖的生成。

活性单位以[蔗糖nmol／(g·min)，Fw]表示。

SPS活性的测定：在蔗糖合成酶反应体系中用10 mmol／L果糖-6-磷酸取代10 mmol／L果糖，其余均按蔗糖合成酶的方法。

活性单位以[蔗糖umol／(g·h)，Fw]表示。

药品配制（按100份）酶液提取1 配制缓冲液A---1000ml200mmol／L Tris—HC1----500ml200m mol／L Tris 12.1g----500ml蒸馏水，200m mol／L HC1／L 8.36ml盐酸（37%）加水491.63ml水将250 ml Tris+233.5 ml HC1，在此液中加入MgC12（分子量95.21，0.9521g），EDTA-Na2（含两个结晶水分子量372，g），巯基乙醇（分子量78，ml），乙二醇（分子量，ml），最后加蒸馏水定容到1000ml2 配制缓冲液B---1000ml 5 ml12.5ml Tris+11.65ml HCl，加入MgC12 0.0238g，果糖（259.19分子量，0.1296g），加入UDPG （Uridine 5′-diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610.27，19.1ug）,定容到25ml 容量瓶12.5ml Tris+11.65ml HCl，加入MgC12 0.0238g，加入果糖-6-磷酸（304.1分子量，0.03041g），UDPG（Uridine 5′-diphosphoglucose disodium salt from Saccharomyces cerevisiae分子量610.27，19.1ug）,定容到25ml 容量瓶3 . 2 mol／L NaOH 50ml 0.4g 定容至50 ml4.0．1％的间苯二酚1g 999ml 蒸馏水5．做蔗糖标准曲线植物组织ATP酶活性测定一、原理ATP酶（adenosinetriphosphatase）可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应放出大量能量，以供生物体进行各需能生命过程。

作业指导书O P E R A T I N G I N S T R U C T I O N S蔗糖转化酶活性的测定编号：XZJY032-00-2019版本：第一版第0次修改编制：审核：批准：实施日期：2019.03.01一、编制目的为规范单位对蔗糖转化酶活性检测的操作，编制本作业指导书。

二、适用范围本标准适用于蔗糖转化酶活性的测定。

三、编制依据GB/T 4928-2008《啤酒分析方法》四、实验原理不经巴氏灭菌或高温灭菌的啤酒，酒体中各种酶系仍保持着活性，其中的蔗糖转化酶可以将蔗糖分解为葡萄糖，利用葡萄糖鉴别试纸可以检查酒体中的蔗糖转化酶活性。

五、试剂和材料5.1 蔗糖溶液（250g/L）：称取蔗糖25g，用水溶解，并定容至100mL。

5.2 葡萄糖鉴别试纸。

六、仪器6.1 移液管。

6.2 试管。

6.3 恒温水浴：控温精度±0.5℃。

七、操作步骤分别吸取酒样10mL于三支试管中。

于第一支试管中加水2.0mL，摇匀。

将第二支试管置于沸水中加热2min，取出冷却。

于第二支试管和第三支试管中各加入2.0mL蔗糖溶液，摇匀。

然后三支试管同时置于30℃±0.5℃水浴中保温30min。

随后将三支试管再同时置于沸水中加热2min，取出，冷却至室温。

分别用葡萄糖鉴别试纸的一端浸入各试管中30s~60s，取出，立即观察其颜色变化，记录结果。

八、判定若C管试纸变色且颜色深于A管和B管，则判为生啤酒或鲜啤酒。

若不变色或者与A管和B管颜色无差别，则判为熟啤酒。

鲜样1g（不同处理天数的第一片真叶或者根系，保存于－80℃冰箱中的）↓加入0.5g pvpP和10mL Hepes冰浴研磨成匀浆（50mMHepes－NaOH pH 7.5缓冲液体系配制1L。

Hepes：11.9150gNaCl：16.0gKCl：0.74gNa2HPO4·12H2O：0.543g葡聚糖： 2gEDTA： 0.3722gMgCl2： 2.0330gDTT： 0.3856gVc： 1.7614g）↓四层纱布过滤↓12000g，4℃，离心20min，用石英砂配平↓弃沉淀，留上清液，加5.6g硫酸铵，加入后充分搅动，充分溶解↓放置15min，用空管加水与离心管配平↓12000g，4℃，离心20min↓弃上清液，沉淀内加入3mLHepes溶解，移到透析袋内↓透析袋放到盛有20mL稀释10倍的Hepes↓4℃冰箱内透析20h即为酶液1.AI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到4.8↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓每个试管中加入1mL蒸馏水，空白加2mL蒸馏水↓在加1.5mL3,5-二硝基水杨酸（DNS）↓520nm比色（比色前混匀）2.NI活性测定25mL刻度试管内加入0.6mL Na2HPO4（0.1M）柠檬酸调pH到7.2↓加0.2mL（0.1M）蔗糖↓加0.2mL酶提取液↓37℃孵育30min↓沸水浴5min，流水冷却↓每管加21.5mL蒸馏水↓520nm比色（比色前混匀）3.蔗糖合成酶（SS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）4.蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性测定25mL刻度试管内加入0.1mL 6-磷酸果糖（0.05M）↓加0.1mLUDPG↓加0.1mLTris（0.1M）↓加0.1mLMgCl2（10mM）↓加0.2mL酶液↓37℃孵育30min↓100℃水浴1min，加0.4mL蒸馏水定容至1mL（空白加1mL蒸馏水）↓加0.1mLNaOH（2N）↓沸水浴10min，流水冷却↓加3.5mLHCl（30%）↓加1mL间苯二酚（0.1%），摇匀↓80℃水浴10min，流水冷却↓480nm比色（比色前混匀）。

糖原合成酶（GCS）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：BC3335规格：100T/96S产品简介：糖原合成酶（Glycogen synthase,GCS）将UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非还原端，以α-1,4糖苷键连接。

GCS是动物机体糖原合成过程的限速酶，同时也是胰岛素作用的主要靶酶，在糖代谢及维持血糖相对稳定的过程中有着重要作用。

GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH生成NAD+，在340nm下测定NADH的下降速率，即可反映GCS活性。

试验中所需的仪器和试剂：紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

产品内容：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体18mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体7.5mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体14μL×1支，4℃避光保存。

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存。

试剂五：粉剂×1支，-20℃保存。

试剂六：液体48μL×1支，4℃避光保存。

试剂七：粉剂×1支，-20℃保存。

试剂八：粉剂×1瓶，4℃避光保存。

工作液的配制：临用前将试剂三、试剂四和试剂五转移到试剂一中混合溶解后待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。

-20℃保存2周。

试剂八的配制：临用前在试剂八中加入5mL试剂二充分溶解，再将试剂六和试剂七转移到试剂八中混合溶解后待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。

-20℃保存1周。

操作步骤：一、粗酶液提取：组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，8000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。

本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。

在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose 柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。

在实验过程中，虽然我们很努力, 但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。

关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose 柱层析分子筛层析Km 前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。

随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。

这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。

由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。

各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。

酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。

就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。

其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。