蛋白质分析

蛋白质分析组成C：50-55%H：6-8%球状蛋白质纤维状蛋白质根据组成分类活性蛋白质（如酶蛋白、转运蛋白、运动蛋白、保护和防御蛋白、受体蛋白…...）非活性蛋白质（如硬蛋白、角蛋白）简单蛋白质结合蛋白质氨基酸amino acid—蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构(primary structure)。

这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。

例：牛胰岛素的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的二级结构一条多肽链或一部分依靠氢键维持的局部有规则的构型－－二级结构。

按线性序列来说，二级结构涉及互相接近的氨基酸残基的空间关系。

肽链中的酰胺平面绕C α相继旋转一定角度形成α-螺旋，并盘绕前进。

每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈；每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm ，旋转100°。

α-螺旋结构的主要特点：1.α-螺旋(α-helix)二级结构单元的种类(β-pleated sheet)β-turn）紧密的借各种次级键维持的尽量地聚集在一起，从而在蛋白质内亲水侧链则位于蛋白质的表面。

级结构疏水作用氢键范德华力离子键二硫键配位键基本作用力级结构：寡聚蛋白质中不同种类和数目的亚布及亚基之间的相互作用。

3.2蛋白质的重要性质3.2.1胶体性质蛋白质的分子量1万-100万之间，其分子直径1-100nm之间，在胶体颗粒的范围。

蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在、蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如−NH3−COO-、−OH-、−SH、−CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成一层水膜。

蛋白质胶体性质的应用透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。

这种方法称为透析（dialysis）。

盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。

同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting out）。

3.2.2两性解离及等电点蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和酸作用，也能和碱作用。

蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的α-氨基和α-羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧链基团如ε-氨基、β-羧基、γ-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。

在一定的pH条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质带电。

蛋白质的等电点（pI）：当某蛋白质在一定的pH的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等电点。

蛋白质的带电性质与溶液的pH有关。

利用蛋白质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。

3.2.3 蛋白质的变性1.蛋白质变性的概念蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。

当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致蛋白质一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。

2.蛋白质变性的因素物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等；化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等；其中比较重要的几种：(1)热变性由于加热而引起的蛋白质变性。

一般蛋白质在50～60℃以上便发生热变性。

热变性有可逆和不可逆之分，但多数是发生凝聚和沉淀的不可逆变性。

(2)酸和碱变性由于酸和碱与蛋白质上的碱基或酸性氨基酸残基的相互作用，使维持蛋白质构型的分子内有利的荷电吸引力变成静电排斥作用，因而导致其结构松散。

蛋白质一般在pH4～10范围内稳定，超过此范围就可发生变性。

蛋白质在其等电点附近才比较稳定。

(3) 尿素和盐酸胍变性常用的两种蛋白质变性剂。

在浓度为6mol/L的试剂作用下，大多数蛋白质都由折叠构型变成完全伸展的构型。

寡聚体都离解为亚基，有的蛋白质还发生凝聚或沉淀。

(4) 表面活性剂变性例.十二烷基硫酸钠(SDS)易与蛋白质结合，使其变性。

SDS的脂肪族长链可与蛋白质内部的非极性基团相互作用，而带负电荷的硫酸根可溶于水中。

在SDS的作用下，蛋白质分子的构型发生变化，寡聚体离解成亚基，亚基由球状变成细杆状。

杆状的SDS-蛋白质复合物，其表面分布大量的SDS负电基团，因而易溶于水。

电泳法蛋白质分子量测定3.蛋白质变性后的表现生物活性丧失（酶）；溶解度降低，粘度增大，扩散系数变小（蛋清）；基团位置改变，光谱特性改变；对蛋白酶敏感性增大；应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老……变性作用若不过于剧烈，则是一种可高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构有的理化性质和生物活性，这种现象称。

蛋白质变性后，很难复性。

3.2.4蛋白质的沉淀加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质的胶体溶液就不再稳定,并将产生沉淀。

能使蛋白质沉淀的试剂有：1.高浓度中性盐（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白质的电荷）这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，用于蛋白质分离制备。

2.有机溶剂丙酮、乙醇(破坏蛋白质水膜)3.重金属盐Hg2+、Ag+、Pb+（与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构）4.生物碱试剂苦味酸、目酸、钨酸等（与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）5.酸碱（等电点沉淀）6. 加热变性沉淀析析的意义认识：研究生命科学研究向分析化学家提出的课题。

种蛋白质的组成、结构与功能的关系；蛋白质的与小分子、金属离子的相互作用等等。

是一个难题蛋白质分子量大（一般为6000～1000000）结构复杂（有四级结构）种类繁多（约有1010～1012种）如：成人血清总蛋白正常值60～82 g/L总蛋白值升高多发性骨髓瘤巨球蛋白血症总蛋白值降低肾病综合征营养不良蛋白质合成障碍3. 评价健康状况、诊断疾病蛋白质测定利用蛋白质的共性利用蛋白质中的特定基团3.3.2 蛋白质分析方法蛋白质的分析方法有多种多样克氏定氮法金属络合物染料作探针的分光光度法荧光染料作探针的荧光分析法化学发光分析法气相色谱法液相色谱法全自动氨基酸分析仪（一）光谱法谱NMR XRD 光谱法1. 紫外吸收光谱法蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。

蛋白质质量浓度/（mg/ml ）=1.55A 1cm -0.76A 1cm280 260测定范围：0.1～0.5mg/mL蛋白质浓度测定的两个经验公式：(1) Lowry-Kalckar 公式2600.74A −280蛋白质浓度(mg/mL)＝1.45A (2)Warburg-Christian 公式与吸收光谱法相关的研究主要包括两个方面：(1)导数法用于蛋白质的定性和定量分析。

如蛋白质及天然芳香氨基酸的鉴别。

(2) 蛋白质结构及构型的研究。

蛋白质构型变化时，蛋白质生色基所处的微环境变化，其吸收峰将发生红移或蓝移。

2. 荧光光谱法蛋白质的荧光来自于具有紫外吸收的三种氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸蛋白质的内源荧光主要是酪氨酸和色氨酸残基的综合贡献。

荧光法定量分析蛋白质结构和构型研究原理：消化Ø样品中含氮有机化合物经浓硫酸加消化，硫酸使有机物脱水；同时有机物炭化生成炭；Ø炭将硫酸还原为SO 2，C 则变为CO 2；ØSO 2使氮还原为氨，本身则氧化为SO 3；Ø在反应过程中生成的氢，又加速氨的形成；Ø生成物中水和SO 2逸去，氨与硫酸结合生硫酸铵留在溶液中。

凯氏(Kieldahl)定氮法（二）化学方法（三）光谱探针法1.双缩脲法(Biuret Assay)双缩脲反应双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。

双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。

蛋白质分子中含有许多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。

通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅用分光光度法进行蛋白质的定量测定。

红紫色络合物(硷性溶液)Cu 2+2. 劳里(Lowry)法利用一种检测酚基的Folin试剂：磷钼酸盐－磷钨酸盐双缩脲试剂与蛋白形成的Cu2+-蛋白质络合物还原Folin试剂磷钼酸盐-磷钨酸盐钼蓝和钨蓝产物在600～800nm范围内有一个宽的吸收峰测定在750nm处进行方法灵敏度高，可达5µg/mL3.茚三酮法茚三酮反应和α-由于蛋白质多肽链两端有游离的α-NH2 COOH，所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应，从而测定蛋白质。

（四）染料结合法基于人们在20世纪初观察到蛋白质使一些酸碱滴定指示剂颜色改变的现象。

早期的研究兴趣在于pH的测定及酸碱指示剂的胶体误差问题。

20世纪40年代，Klotz等经过系统研究，认识到蛋白质对有机染料吸收光谱的影响可以用于研究蛋白质与小分子的相互作用。

利用这种相互作用对蛋白质进行定性及定量分析1. 甲基橙(Methyl Orange)法甲基橙是一种双色指示剂，在溶液中存在以下平衡：在pH3.5时，甲基橙溶液实为两种形式的混合物，此时若加入血清白蛋白，蛋白质实际上只与偶氮式结合；醌式减小的程度与蛋白质的量之间具有线性关系。

2.考马氏亮蓝法G-250 法(Coomassie Brilliant Blue, CBB)在酸性条件下(1.46mol/L H3PO4介质)，CBB的颜色为浅红色，最大吸收波长464nm和595nm。

与蛋白质反应后生成深蓝色的复合物，在595nm处的光吸收强度大大加强。

根据此波长下的吸光度可对蛋白质进行定量分析。

CBB是研究最多的三苯甲烷类染料。

3. 溴甲酚绿(Bromocresol Green)和溴甲酚紫(Bromocresol Purple)法溴甲酚绿在pH4.2时可选择性地与白蛋白结合，使染料在630nm处的吸收大大加强。

染料本身是黄色；但与蛋白质形成复合物后为深蓝色。

方法的最低检出限：50µg4. 荧光染料法荧光染料在与蛋白质结合之后，由于荧光染料所处的微环境的改变，使其荧光量子产率及波长均可发生很大的变化。

例. 荧光染料1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)在水溶液中的荧光量子产率很小；但在非水溶剂中荧光量子产率大增；荧光峰蓝移。

如：ANS在水溶液中的荧光量子产率0.004，荧光发射波长515nm；当其与去辅基的肌红蛋白和血红蛋白结合后，其荧光量子产率改变为0.98；发射波长454nmANS与蛋白质的结合区域的疏水性很强3.4蛋白质的的分离、纯化与鉴定3.4.1 蛋白质分离、纯化的过程和一般原则（1）前处理（Pretreatment）---细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。