Folin-酚比色法测定蛋白质含量

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量Folin-酚试剂法测定蛋白质含量一、实验目的1，掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其具体实验操作技术；2，掌握制作标准曲线的要领；3，学会通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理1，蛋白质分子中含有的肽键在碱性条件下可以与Cu2+螯合形成蛋白质- Cu2+复合物，即发生双缩脲反应。

而此复合物中的含酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基可以还原Folin-酚试剂的磷钼酸盐-磷钨酸盐，产生蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物），即发生Folin-酚显色反应。

同时，在碱性条件下Folin-酚试剂极不稳定，从而易被蛋白质还原而呈蓝色反应。

2，在一定浓度范围内，蓝色化合物的蓝色深浅与蛋白质浓度呈正比。

故通过测定相应浓度梯度的蛋白质标准溶液吸光度可依其作出标准曲线，以此绘制的标准曲线和供试品中蛋白质溶液吸光度可求出供试品中蛋白质的含量。

三、材料和方法样品：健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L试剂：牛血清白蛋白标准液（200µg/ml）；碱性硫酸铜溶液（现配）；Folin-酚试剂仪器与器材： V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；加样枪、加样枪架；坐标纸实验步骤示意详细步骤A ，配置一定浓度梯度溶液: 取6支试管分别编号1至6，按下表加样。

（1作空白对照，2-5作标准，6为待测样品）1，加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时：于一号试管加入碱性硫酸铜溶液2ml 后等待一分钟再往下一支试管加入同量的碱性硫酸铜溶液，摇匀。

如此类推混匀并将其静置在室温下。

2，在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之至距第一支试管加样10分钟后，于第1支试管立即加入0.20mL Folin-酚试剂，并于2s 内摇匀。

1分钟后第2支试管加入0.20mL Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。

B ，加样完毕后将各试管每隔1min 按1-6顺序放一只试管入水浴箱，分别40℃水浴10min 后取出冷却至室温。

folin酚法测定蛋白质含量Folin-酚法是一种测定蛋白质含量的经典方法，其历史可以追溯到1948年。

此方法的基本原理是酚类物质在碱性条件下与蛋白质反应，生成一种深蓝色的复合物，该复合物在760nm处的吸光度与蛋白质浓度成正比，因此可以通过测定吸光度来计算蛋白质浓度。

以下是Folin-酚法测定蛋白质含量的详细步骤：一、实验准备1.实验材料：o待测样品（蛋白质溶液）o Na2CO3o NaHCO3o硫酸铜o酒石酸钾钠o氯仿o无水乙醇o磷酸二氢钾o氢氧化钠2.实验设备：o分光光度计o研钵或电动搅拌器o漏斗和滤纸o玻璃试管和试管架o移液管o搅拌棒二、实验步骤3.准备Folin-酚试剂：将10g的酒石酸钾钠与50g的Na2CO3、NaHCO3混合在研钵中，充分研磨后转移至烧杯中，加入80ml的蒸馏水，搅拌至溶解。

将溶液煮沸并保持1分钟，然后冷却至室温。

将混合物转移至1L容量瓶中，用蒸馏水定容至1L。

4.取1ml待测蛋白质溶液（约0.01-1mg蛋白质）加入到试管中。

5.向试管中加入5ml Folin-酚试剂，混匀。

6.将混合物在室温下保持30分钟，期间不时搅拌。

7.在760nm波长下，用分光光度计测定混合物的吸光度。

为了获得更准确的结果，可以以蒸馏水为空白对照调零。

8.根据标准曲线计算蛋白质浓度。

可以通过绘制已知蛋白质浓度与其对应的吸光度的曲线图来制作标准曲线。

根据待测样品的吸光度，可以在曲线上找到对应的蛋白质浓度。

9.根据需要，可以进一步计算蛋白质的含量（mg/mL或mg/g）。

三、注意事项和局限性1.Folin-酚法对碱性环境非常敏感，如果在试剂准备和混合过程中出现不慎或操作不当，可能会影响到最终的测定结果。

因此，操作者需要熟练和准确的掌握该方法的操作步骤。

2.本方法不适用于测定含有大量酚类物质或还原性物质的样品，这些物质可能会干扰蛋白质与Folin-酚试剂的反应，导致结果偏差。

3.一些蛋白质的氨基酸序列中含有酪氨酸或色氨酸残基，这些残基可以与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，导致吸光度偏高，最终结果可能偏高也可能偏低。

蛋白质含量测定方法——Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸残基在Folin试剂存在下氧化成碘，与酚试剂结合形成一种蓝色复合物。

由于蛋白质的量与Folin 试剂呈正比，因此可以通过比色法测定蛋白质含量。

步骤：1. 准备一系列浓度的标准蛋白质溶液（从低到高），并设置空白对照。

2. 取一定量的Folin试剂和样品混合，充分摇匀后静置2-3分钟。

3. 用酚试剂对样品进行稀释，制备出一系列浓度的标准样品。

4. 对比观察各标准样品的颜色变化，找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。

5. 绘制标准曲线，再用于样品蛋白质的测定。

6. 根据样品中剩余的Folin试剂颜色，求出样品中的蛋白质含量。

注意事项：1. 必须严格控制反应温度和时间，以免影响测定的准确度。

2. 在加入Folin试剂后，需要摇动几次以确保充分反应。

3. 如果要测定的样品含有维生素C或其他具有抗氧化性质的物质，需要事先进行去除或中和。

4. 对于浓度过高的样品，建议先进行稀释再进行测定。

在实践中，除了遵循以上步骤，还可以参考以下技巧和经验：* 使用干净的玻璃器具来操作，避免使用塑料器具导致的颜色干扰。

* 在加入Folin试剂后，可以加入少量无水乙醇来稳定颜色反应。

* 在绘制标准曲线时，可以使用不同浓度的标准蛋白质溶液制备一系列梯度样品，这样可以更准确地找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。

* 对于未知样品，可以先进行预实验，大致确定蛋白质浓度范围，以便更好地控制实验进程。

总之，Folin—酚试剂法是一种简便、灵敏的蛋白质定量方法，通过遵循正确的步骤和注意事项，可以获得较为准确的测定结果。

实验一 Folin-酚比色法测定蛋白质含量一. 目的学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法二. 原理Folin-酚法，又名Lowry法，所用的试剂由两部分组成：试剂甲为碱性硫酸铜溶液，相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中肽键起双缩脲反应，生成Cu2+-蛋白质络合物；试剂乙为磷钨酸-磷钼酸混合物，在碱性条件下极不稳定，易被上述络合物以及酪氨酸和色氨酸残基还原成钨蓝和钼蓝。

在一定蛋白质浓度范围内，钨蓝和钼蓝在500nm波长处的光吸收与蛋白质含量成正比，以此可测定蛋白质的含量。

该方法灵敏度高，测定范围为25μg～250μg，比双缩脲法灵敏100倍，用作一般浓度的测定较为适宜，且操作简便、快速，所以是一般实验室中经常使用的方法之一。

注意，酚类物质、柠檬酸、甘氨酸、EDTA、各种糖以及各种还原剂等对测定均有干扰作用。

三. 实验材料及设备1. 材料绿豆芽2. 仪器分光光度计电子天平3. 器材普通试管：20mL×8容量瓶：100mL×1移液管：1mL×4 5mL×1烧杯：250mL×1 50mL×1滤纸：φ11cm滴管： 2洗耳球： 2坐标纸研钵、漏斗、洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1四. 试剂的配制1. 牛血清白蛋白标准液（250μg/mL）精确称取0.0250g牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后定容至100mL。

2. Folin-酚试剂甲●溶液A：Na2CO310gNaOH 2g 用蒸馏水溶解后定容至500mL；酒石酸钾钠0.25g●溶液B：CuSO4·5H2O 0.05g 用蒸馏水溶解后定容至10mL；●使用前，将溶液A和溶液B以50:1相混合。

该混合液只能保持一天。

3. Folin-酚试剂乙●在1500mL容积的磨口烧瓶中，加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠(NaMoO4·2H2O)及700mL蒸馏水，再加入50mL 85%正磷酸和100mL浓盐酸，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10小时。

实验报告综合试验(三Folin-酚法测定蛋白质含量2010年 6 月3日摘要:本实验包括两个步骤,第一个步骤为制作标准曲线,第二个步骤为制备样品(牛奶和酪蛋白粗制品并用Folin —酚法进行蛋白质含量的测定,得到酶原液蛋白含量为8923 (ug/ml;洗脱峰Ⅰ蛋白含量82.692(ug/ml;洗脱峰Ⅱ蛋白含量121.923(ug/ml; 洗脱峰Ⅲ蛋白含量83.077(ug/ml。

此次实验与理论值仍存着一定的偏差。

通过本次实验的操作以及对实验结果的分析,了解Folin —酚法准确测定蛋白含量的原理方法,以及其相关的影响因素。

一、实验目的:1、测定实验中原液和洗脱液中蛋白质的含量2、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

3、熟悉分光光度计的操作。

二、理论背景:Folin-酚试剂法包括两步反应:第一步是在碱性条件下, 蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物; 第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin 试剂还原, 产生深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物,颜色深浅与蛋白质含量成正比。

此法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100 倍,定量范围为5~100μg蛋白质。

Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起, 因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

此外, 不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

三、实验装置:1. 实验材料原液, 洗脱峰2. 仪器(1移液管(0.5mL 、1mL 、5mL (2量筒(3 分光光度计(4 移液管、移液枪3. 试剂(纯度均为分析纯(1 0. 5mol/L NaOH(2 试剂甲:(A 称取10g Na2CO 3, 2g NaOH和0.25g 酒石酸钾钠,溶解后用蒸馏水定容至500mL 。

(B 称取0.5g CuSO 45·H 2O ,溶解后用蒸馏水定容至100mL 。

每次使用前将(A 液50份与(B 液1份,即为试剂甲,其有效期为1d ,过期失效。

实验二 Folin-酚法测定蛋白质含量一、目的要求了解Folin–酚法测定蛋白质的原理，掌握Folin–酚法测定蛋白质含量的分析方法。

二、实验原理用化学法测定蛋白质含量的方法主要有凯氏定氮法、双缩脲比色法、Folin–酚比色法、考马斯亮蓝比色法等。

凯氏定氮法多用于贮存蛋白的测定；后者常用于可溶性蛋白的含量分析，它们具有操作简便，迅速，可适合一般实验要求的特点。

其中Folin–酚法较双缩脲法灵敏100倍，与考马斯亮蓝比色法灵敏度相似，但干扰物对检测方法的影响不相同，选用时应予考虑。

Folin–酚试剂由甲、乙两部分组成。

作用机理是：首先蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，生成铜—蛋白质复合物；然后该复合物还原磷钼酸—磷钨酸试剂，产生蓝色反应，其呈色强度与蛋白质含量成正比。

所测定蛋白质样品中若含有酚及柠檬酸均对实验有干扰。

浓度较低的尿素（约0.5%），三氯乙酸（约0.5%），乙醇（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响。

若样品酸度较高，需提高碳酸钠—氢氧化钠溶液浓度1–2倍。

三、试剂和仪器（一）试剂1、酪蛋白标准溶液：称取50mg酪蛋白（预先用凯氏定氮法测定蛋白质含量），加30mL 0.05mol/L NaOH ，于磁力搅拌器下溶解，补加0.05mol/L NaOH 至100 mL。

酪蛋白含量0.5 mg/ mL。

2、Folin-酚试剂试剂甲：（1）4% Na2CO3；（2）0.2 mol/L NaOH；（3）1%CuSO4；（4）2%酒石酸钾钠溶液。

使用前，将（1）与（2）以等体积混合配置成Na2CO3–NaOH溶液；（3）与（4）以等体积混合，配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液；然后将这两种溶液以50:1的体积混合，即为Folin–酚试剂甲。

该试剂只能用一天，过期失效。

试剂乙：在1000 mL磨口回流装置内加入50g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O），12.5g 钼酸钠（Na2M O O4·2H2O），350 mL 85%磷酸，50 mL浓盐酸，混匀。

Folin-酚试剂法测蛋⽩质含量实验1-3 蛋⽩质的定量测定（Folin-酚试剂法）⼀、实验原理1921年，Folin ⾸创Folin-酚试剂法，利⽤蛋⽩质分⼦中酪氨酸和⾊氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝⾊反应；1951年，Lowry对此法进⾏了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提⾼了灵敏度。

Folin-酚试剂法主要包括两步：第⼀步双缩脲反应在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与Cu2+作⽤,形成紫⾊或紫红⾊的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。

由于蛋⽩质分⼦中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋⽩质分⼦中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作⽤⽣成紫红⾊的蛋⽩质- Cu2+复合物。

第⼆步Folin-酚显⾊反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原⽽呈蓝⾊反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。

由于蛋⽩质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显⾊反应。

即蛋⽩质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或⾊氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，⽣成蓝⾊的化合物。

在⼀定浓度范围内，蓝⾊的深浅度与蛋⽩质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋⽩质标准液⽐⾊即可求出样品中蛋⽩质的含量。

另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋⽩质的含量。

⼆、实验材料（⼀）样品健康⼈⾎清（稀释300倍）（⼆）试剂1．⽜⾎清⽩蛋⽩标准液（200 g/ml）准确称取⽜⾎清⽩蛋⽩粉末50.0mg，⽤0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏⽔到250ml。

2．碱性硫酸铜溶液①碱溶液：Na2CO3 2g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。

②硫酸铜溶液：CuSO4?5H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒⽯酸钾钠中。

使⽤前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。

使⽤时新鲜配制。

3．Folin-酚试剂在2L磨⼝回流装置内加钨酸钠（Na2WO4?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g，蒸馏⽔700ml，14.68mol/L（85%）磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后⽤⼩⽕回流10h。

实验8 Folin—酚法测定血清蛋白质含量一、目的1、学习分光光度计的原理和使用方法。

2、学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法。

3、进一步掌握比色法或分光光度法，准确测定未知样品。

二、原理蛋白质浓度从它们的物理化学性质，如折射率，比重，紫外吸收测定而得知，或用化学方法，如定氮，双缩脲反应，Folin—酚法是一般实验室中经常使用的方法。

Folin—酚法是双缩脲法的发展，反应的第一步涉及到在碱性溶液中铜一蛋白质复合物的形成，然后这个复合物去还磷钼酸—磷钨酸试剂（Folin氏剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。

Folin—酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。

所测蛋白质样品中若含酚类及柠檬酸均有干扰作用，浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%）乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色反应影响，这些物质浓度高时必须做校正曲线。

含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液即可显色测定。

若样品酸度较高，显色后色浅。

则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1—2倍。

三、材料、试剂与器具（一）材料血清：使用前稀释100%（二）试剂1、标准酪蛋白溶液：称取125毫克酪蛋白粉末，用0.1N氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水到250 毫升，则配成500微克/毫升的标准酪蛋白溶液。

2、Folin—酚试剂甲：由下述四种溶液配制而成。

（1）4%碳酸钠溶液（2）0.2N氢氧化钠溶液（3）1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液（4）2%酒石酸钾钠溶液，在使用前，将（1）和（2）等体积混合成碳酸钠—氢氧化钠溶液。

将（3）与（4）等体积混合配成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。

然后将这两种溶液按50：1的比例混合，即为Folin—酚试剂甲。

该试剂只能用一天，过期失效。

3．Folin—酚试剂乙：在2升的磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100克，钼酸钠（Na2MOO4·2H2O）25克，蒸馏水700毫升，85%磷酸50毫升和浓盐酸100毫升，充分沸合后以小火回流10小时，再加入硫酸锂（L i2SO4）150克，蒸馏水50毫升及数滴液体溴。

Folin-酚法测定蛋白质含量一、目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。

二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。

此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。

Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。

此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）2．仪器（1）722型（或721型）分光光度计（2）4000r/min的离心机（3）分析天平（4）容量瓶（50mL）（5）量筒（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）3．试剂（纯度均为分析纯）（1）0.5mol/L NaOH(2)试剂甲：（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH和0.25g酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。

（B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。

每次使用前将（A）液50份与（B）液1份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。

（3）试剂乙：在1.5L容积的磨口回流器中加入100g钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和700mL蒸馏水，再加50mL85％磷酸和100mL浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。

回流结束后，加入150g硫酸锂和50mL蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。

然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L。

04Folin酚法测定蛋白质含量Folin酚法是一种测定蛋白质含量的方法，也被称为Lowry法。

该方法利用一种化学试剂（Folin酚试剂）与蛋白质结合形成复合物，进而产生颜色，利用光度计测量颜色强度，从而间接测定蛋白质的含量。

本文将对Folin酚法的操作流程、原理、注意事项等方面进行介绍。

Folin酚法的操作流程如下：1. 样品制备：将要测定蛋白质含量的样品加入到离心管中，并加入约5倍体积的碳酸氢钠（NaHCO3）溶液，使样品呈弱碱性，再加入NaCl，使浓度为50-100mM。

2. 加入Folin酚试剂：按照试剂的工业需求用水稀释Folin试剂，取样品中的0.1-2.0mL加入到TestTube中，再加入等量的加热后冷却的NaOH(1M) ，然后加入Folin试剂，快速摇匀并放置15分钟至30分钟。

会出现从棕色到蓝色等级变化（酚蓝色）。

3. 加入Na2CO3：在试管中加入5倍浓度的Na2CO3溶液，缓慢滴加并充分混合，使液体呈现深蓝色（如图），在紫外线灯下，黄色到红色颜色具有固定的比色距离和线性使用范围，通常是500-700nm。

4. 测量吸光度：样品和对照体使用小细长试管，在波长下读取吸光度数据。

对每一标准曲线，使用标准品生产的校正硝酸钠或牛清蛋白制备出蛋白标准品。

在制定标准曲线时，使用的标准品范围是0.1-1.0mg / ml因为该范围内蛋白质浓度的吸光度与蛋白质浓度之间的线性关系较好。

对一定量的蛋白质或多肽样品添加到含有Folin试剂和NaOH的试剂中，在碱性条件下，Folin试剂会被蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等还原物质还原，形成可被吸收的蓝色化合物。

随着Na2CO3添加，蛋白质中的肽键还原Cu2+为Cu+，与Folin试剂中还原少量的Cu2+形成可吸收的化合物，产生蓝色颜色。

其实质是铜离子作为氧化剂，被蛋白质中的酚类、组氨酸等还原，然后由还原形成的电子捕获剂向Folin试剂中的fosfomolybdate 复合物媒介过渡，形成可吸收的复合物，具体反应方程式如下：a. Cu(II)+RNHCO-R’-R’’ → Cu(I)+R-NH2 + R’CO-R’’（还原）b. Cu(I)+3MeOH+NaF-Fe(III)(CN)5(NO) → Fe(II)(CN)5NO+NaF+Cu(II)+3MeOHc. Folin-Ciocalteu试剂+Copper-chelating(还原Cu2+->Cu1)+MeOH+(±)Na2CO3 → (MeOH的)紫色染料吸收（‘Folin-Ciocalteu’光度分光光度），与Na2CO3浓度成比例注意事项：1.样品的体积或质量应该控制在不同范围内，不宜过多或过少。

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一、实验目的1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。

2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。

二、实验原理Folin-酚反应是利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。

为了提高该反应的敏感度，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应。

1、双缩脲反应：在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。

由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。

即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

2、Folin-酚显色反应：蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。

即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。

三、材料与方法：以流程图示意1、材料：①样品：健康人的血清（稀释300倍）②试剂：牛血清蛋白标准液（200μg/ml ）、碱性的硫酸铜溶液、蒸馏水、Folin-酚试剂③仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头2① 取6支试管编号1~6，按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min 。

表格 1 Folin-酚试剂定量蛋白质实验步骤② 往6支试管中分别加入Folin-酚试剂0.20ml ，在2s 内立即混匀。

Folin-酚法测定蛋白质含量是一种灵敏的方法，最早由Lowry确定蛋白质浓度测定的基本步骤。

这种方法的显色原理与双缩脲法相同，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。

Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。

在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。

此法使用的试剂有A液和B液。

A液由4%碳酸钠（Na2CO3）溶液与0.2mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液等体积混合而成。

B液由1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶液与2%酒石酸钾钠溶液等体积混合而成。

每次使用前将A液与B液按50：1的比例混合即成。

这种试剂只能使用一天，过期失效。

在进行测定时，先将试剂乙倒入试剂甲中，摇匀后立即用其测定的样品，在一定条件下进行显色反应，之后在规定时间内记录光密度值，以测定蛋白质含量。

请注意，Folin-酚法在操作过程中需要注意一些细节，比如试剂的配制和保存、样品的处理、显色反应的条件等。

具体操作步骤和注
意事项建议咨询专业人士。