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基于真空渗入法的转基因大白菜植株的获得赵静;吴俊清;李庆飞;张静;张鲁刚【摘要】采用真空渗入法,将萝卜VPE1基因的干扰载体pRNAi-Rs VPE1转入大白菜中,共收获2 414粒种子,在质量浓度为30 mg/L的卡那霉素筛选下获得抗性株297株,其中9株经PCR检测呈阳性,转化率为0.37％.Real-time PCR检测结果表明,pRNAi-Rs VPE1的转入导致转基因大白菜叶片中同源的Br VPE在RNA水平上的表达量下降,验证了转基因植株的可靠性,为进一步深入研究BraVPE基因功能奠定了基础.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2017(026)002【总页数】7页(P248-254)【关键词】真空渗入法;大白菜;Bra VPE转基因;RNAi载体【作者】赵静;吴俊清;李庆飞;张静;张鲁刚【作者单位】西北农林科技大学园艺学院,农业部西北地区园艺作物生物学与种质资源创新重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,农业部西北地区园艺作物生物学与种质资源创新重点实验室,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,农业部西北地区园艺作物生物学与种质资源创新重点实验室,陕西杨凌712100;山西农业大学园艺学院,山西太古030800;西北农林科技大学园艺学院,农业部西北地区园艺作物生物学与种质资源创新重点实验室,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S634.1大白菜[Brassica campestris L．spp．pekinensis (Lour.) Olsson](AA，2n=20) 属于十字花科芸薹属白菜种，原产中国，有着悠久的栽培历史[1]。
因其产量高、营养丰富及其食用方法的多样性深受中国及世界人民的喜爱。
近年来，利用转基因技术，将外源目的基因转入到植物体内可以更快、更直接地进行目标性状的改良。
转基因技术与常规育种技术相结合，不仅可以缩短育种周期、稳定后代选择，而且可以增强育种目的性，提高育种效率。
利用RNA干扰技术抑制四九菜心中黑芥子酶基因的表达的开题报告一、研究背景四九菜心是一种十分常见的蔬菜，广泛种植于世界各地。
然而，四九菜心中的黑芥子酶会影响其品质和口感，给食用带来影响。
因此，寻找有效的手段减少黑芥子酶的含量成为了四九菜心种植和加工的研究热点。
RNA干扰技术是一种逆向基因工程技术，通过在生物细胞内引入人工合成的RNA分子，诱导RNA与靶基因的mRNA互相杂交，进而导致靶基因mRNA的降解和功能的抑制。
因此，利用RNA干扰技术抑制四九菜心中黑芥子酶基因的表达，可以实现减少黑芥子酶含量，进而改善四九菜心的品质和口感。
二、研究目的本研究旨在利用RNA干扰技术抑制四九菜心中黑芥子酶基因的表达，以此改善四九菜心的品质和口感。
三、研究方法1.选择RNAi靶点序列。
根据四九菜心黑芥子酶基因的序列，设计出2~3个满足RNAi靶点设计规则的靶点序列，并进行验证。
2.构建RNAi载体。
根据选择的靶点序列设计合适的RNAi载体，并进行构建和扩增。
将RNAi载体导入大肠杆菌中，进行扩增、纯化和鉴定。
3.将RNAi载体导入四九菜心。
将构建好的RNAi载体通过基因枪等方法导入四九菜心，使其进入细胞并起到RNA干扰的作用。
4.筛选RNAi转化株。
通过PCR、Western blot等方法筛选出表达黑芥子酶的基因表达受到抑制的RNAi转化株，置于合适的培养环境中进行培养并取样分析。
5.鉴定干扰效果。
对转化株进行鉴定干扰效果的相关实验。
如PCR扩增、Western blot、酶活测定等。
四、研究意义通过本研究，可以利用RNA干扰技术在四九菜心中抑制黑芥子酶的表达，实现优化其品质和口感的目的，从而推广四九菜心的种植和加工。
该技术还有可能为其他蔬菜的种植和加工提供参考价值，有一定实践意义。
一、实验背景随着科学技术的不断发展，转基因技术在农业领域的应用越来越广泛。
白菜作为我国重要的蔬菜作物之一，其转基因研究对于提高产量、改善品质、增强抗病性等方面具有重要意义。
本实验旨在通过农杆菌介导法将抗病毒基因导入白菜，探究转基因白菜在抗病毒性方面的表现。
二、实验材料与方法1. 实验材料- 白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）：取材于本地种植的结球白菜。
- 农杆菌：选择含有Ti质粒的根癌农杆菌C58。
- 抗病毒基因：TuMV-NIa及LMV-CP。
- 植物激素：6-BA、NAA、AgNO3。
2. 实验方法1. 基因转化1.1 准备农杆菌：将根癌农杆菌C58在含有卡那霉素的YEB培养基中培养至对数生长期。
1.2 制备外植体：取白菜叶片，用70%酒精消毒后，用无菌水清洗3次，再将其切成小块。
1.3 共培养：将外植体与农杆菌混合，共培养于含有植物激素的培养基上，共培养时间为2-3天。
1.4 诱导再生：将共培养后的外植体转入含有植物激素的再生培养基中，诱导其再生。
1.5 抗性筛选：将再生植株转入含有抗生素的培养基中，筛选出阳性植株。
2. 分子鉴定2.1 PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
2.2 Southern blot检测：将转基因植株DNA进行 Southern blot，检测目的基因是否整合到植物基因组中。
3. 抗病毒性检测3.1 人工接种：将转基因植株和对照植株分别接种TuMV和LMV病毒。
3.2 观察记录：观察记录植株发病情况，比较转基因植株和对照植株的抗病毒性。
三、实验结果1. 基因转化通过共培养和诱导再生，成功获得转基因白菜植株。
2. 分子鉴定PCR和Southern blot检测结果均显示，目的基因已成功导入白菜基因组中。
3. 抗病毒性检测与对照植株相比，转基因植株在接种TuMV和LMV病毒后，发病率明显降低，表现出较强的抗病毒性。
押广东卷基因工程1、（2023广东高考）种子大小是作物重要的产量性状。
研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。
通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
（2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。
为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。
在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。
2、（2022广东高考）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2006,14(1):145~146*基金项目：国家自然科学基金项目(No.30270913)资助。
张战凤:男，1980年生，硕士研究生。
E-mail:<zhanfengg@>.**通讯作者。
Author for correspondence.Tel:(029)-87082131,E-mail:<lugangzh@>.收稿日期：2005-01-05接受日期：2005-04-03·研究简报·大白菜花蕾总RNA有效、快速提取的方法*张战凤张鲁刚**王绮(西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100)关键词：总RNA；大白菜花蕾；改进异硫氰酸胍中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006-1304(2006)01-0145-02An Effective Quick Protocol for Total RNA Isolation From Flower Bud of Chinese CabbageZHANG Zhan-Feng ZHANG Lu-Gang WANGQitotal RNA;flower bud of Chinese cabbage;guanidine thiocyanate modified植物细胞壁厚实且成分复杂，细胞内富含单宁、萜烯、色素、酚等次生代谢物以及蛋白质、多糖等生物大分子，这些物质不但影响提取RNA效率，而且干扰之后的逆转录、酶切实验操作(李宏和王新力,1999)。
不同植物、不同组织或不同生理状态下的植物材料其细胞与组织的成分各不相同，因此，必须针对不同植物组织的特点，对RNA的提取方法进行优化选择。
提取大白菜花蕾总RNA用于基因克隆的报道较少，鉴于此，我们以酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法(Sambrook and Russell,2002)为基础，并作适当改进，提取出较高质量的大白菜花蕾总RNA，并成功的应用于逆转录和cDNA-RAPD 实验。
BcFLCI基因点突变延迟乌菜抽薹的分子机理抽薹开花是十字花科作物从营养生长转向生殖生长关键阶段。
它是内源因素与外界环境共同作用的结果, 适期抽薹对于作物适应当地气候至关重要。
因环境条件和自身遗传等因素, 生产上先期抽薹现象较多, 严重影响了作物产量和品质。
乌菜是十字花科大白菜的一个变种，极耐低温，以富含维生素C而闻名。
作为江淮一带广泛栽培的蔬菜品种, 乌菜先期抽薹问题一直困扰着众多种植者, 而培育耐抽薹乌菜品种正是解决该问题的有效途径, 掌握乌菜抽薹开花的分子机制, 对培育耐抽薹品种意义重大。
十字花科作物抽薹开花可由多个途径控制, 但大部分途径都作用于FLOWERING LOCUS（CLQ 与SHORT VEGETATIVE PAHSSVP 基因,FLC基因编码一个MADS-bo蛋白,与下游基因启动子结合,是一个成花抑制因子。
FLC可与SVP形成蛋白复合体,共同影响下少游FLOWERINLOCUS（FT）与SUPPERSSOR OF OVEREXPRESSION CONSTANT 1 等的表达,进而控制作物的抽薑开花。
本实验通过克隆两个乌菜品种W-1 （耐抽薑）与W-2 （不耐抽薑）的FLC1基因来分析品种间抽薑性状差异的原因,主要研究结果如下：1.成功从乌菜两个品种中克隆出了FLC1基因,经BLAST分析与欧洲油菜FLC1基因相似度最高, 命名为BcFLC1-1及BcFLC1-2,两个基因长591bp,共编码196个氨基酸，经预测该基因编码一个MAD盒和K-Box盒;BcFLC1基因内有两个碱基突变,且后一个碱基的突变造成第174位氨基酸突变。
成功从两个品种乌菜中克隆出SVP S因,长726 bp, 编码241 个氨基酸。
2.在线预测结果表明BcFLC1基因定位于细胞核内,同时,设计引物成功构建了pBI121-35S::BcFLC1-GFP表达载体,并利用EHA105农杆菌介导转化洋葱表皮细胞, 进行亚细胞定位,证实其在细胞内表达。
白菜类作物抽薹开花的分子遗传分析的开题报告一、研究背景和意义白菜类作物（Brassicaceae）包括白菜、芥菜、油菜等重要经济作物，具有重要的生态和农业意义。
然而，在白菜类作物生长过程中，由于生长环境、营养调节等因素影响，不可避免地会出现抽薹开花的现象，这会导致地上部分生长停止，花期提前，影响其经济效益和产品品质。
有研究表明，白菜类作物抽薹开花受到多基因的调控，其中FT基因在其中起着重要的作用。
因此，开展白菜类作物抽薹开花分子遗传分析，有助于揭示影响抽薹开花的遗传因素，提高金属元素转录调控的水平，对于进一步深入了解其生长发育机制、提高生产效益以及产品品质具有重要意义。
二、研究内容和目标本研究旨在通过分子遗传学手段，研究白菜类作物抽薹开花的分子机制，解析其遗传调控机制，鉴定和分析参与抽薹开花的候选基因，为改良抗逆性强、抗病性好的优质品种提供理论依据和技术支持。
具体研究内容：1. 借助基因芯片技术，分析参与白菜类作物抽薹开花的差异表达基因；2. 对差异表达基因进行生物信息学分析，筛选候选基因；3. 利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑载体，对候选基因进行功能鉴定；4. 鉴定功能较为明确的基因，并探究其调控机制。
研究目标：1. 确定参与白菜类作物抽薹开花的关键基因；2. 揭示这些关键基因在分子水平上的调控机制；3. 为培育优良品种提供分子论证依据；4. 拓展和深入了解白菜类作物抽薹开花的分子遗传学知识。
三、研究方法1. 样品采集与处理：从恰当的白菜类作物品种中，选取当地生长适宜的植株作为实验材料，进行实验前处理以及样品采集。
2. RNA抽提和定量：利用Trizol法分离总RNA，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
3. 基因芯片实验：选用差异表达基因显著的样本，进行基因芯片实验，得到高通量的基因表达水平数据。
4. 生物信息学分析：采用BLASTx和COG、KEGG等数据库进行差异表达基因的注释、生物信息学和生物通路分析。
耐抽薹大白菜—结球甘蓝易位系的获得及抽薹相关基因的cDNA-AFLP分析大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis,AA)为种子春化型植物,萌动的种子即可感受低温完成春化,春夏季栽培很容易先期抽薹,使叶球失去商品价值和食用价值,给生产造成巨大损失。
结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)为绿体春化型,较大白菜具有很强的耐抽薹性。
本实验室创制了大白菜染色体组背景下添加1条结球甘蓝染色体的单体异附加系,其中添加结球甘蓝4号染色体的大白菜单体异附加系表现最耐抽薹。
本研究在获得大白菜—结球甘蓝4号单体异附加系及其后代小孢子植株的群体基础上,通过2年抽薹性鉴定,筛选出耐抽薹和易抽薹植株,并进一步利用cDNA-AFLP对耐抽薹和易抽薹植株进行分析。
其研究结果如下：1.以大白菜—结球甘蓝4号单体异附加系及其自交后代的616个来自不同胚的小孢子植株群体为材料,综合考虑显蕾、抽薹、开花性状,采用6级抽薹调查分级标准、5个抽薹评价等级,通过2年抽薹性调查,筛选出60份试验材料,其中45株耐抽薹植株和15株易抽薹植株。
2.通过花粉母细胞减数分裂观察,初步对筛选出的耐抽薹植株染色体数目进行鉴定,获得了耐抽薹大白菜—结球甘蓝易位系。
并对获得耐抽薹和易抽薹植株叶片、花器官、中肋、叶球、根等性状进行了观测。
3.利用cDNA-AFLP技术,选用256对引物组合,对不同春化处理的上述耐抽薹和易抽薹植株叶片差异表达片段进行分离。
获得差异条带124条,包括1)耐抽薹材料有条带,易抽薹材料无条带的差异条带71条。
包括耐抽薹材料不同春化处理间相关产物持续表达14条,递增表达41条、递减表达16条；2)耐抽薹材料无条带,易抽薹材料有条带的差异条带53条。
包括易抽薹材料不同春化处理间相关产物持续表达8条,递增表达28条,递减表达17条。
受低温调控表达的差异条带共10条,包括耐抽薹材料有条带,易抽薹材料无条带的4条；耐抽薹材料无条带,易抽薹材料有条带的2条；耐易材料均表达的4条。
专利名称：一种农杆菌介导的大白菜转基因方法
专利类型：发明专利
发明人：朴钟云,赵玉竹,李晓楠,庞文星,战宗祥,朴英兰申请号：CN201810720025.7
申请日：20180703
公开号：CN108642080A
公开日：
20181012
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种农杆菌介导的大白菜转基因的方法。
所述方法通过用含有待转基因的农杆菌侵染液侵染大白菜籽苗的带柄子叶，成功的将目的基因转入大白菜的基因组中。
经多次重复试验，本发明所提供的方法最高转化率为13.5％，平均转化效率8％，所得方法的基因转化的效率高。
此外，本发明提供的方法中，多种培养基的组成成分和浓度配比基本一致，培养基无需反复更换、改变浓度，极大的简化了转基因操作过程，所得方法简便高效。
本发明利用该方法建立了稳定的大白菜转基因体系，为大白菜分子育种及基因功能研究奠定基础。
申请人：沈阳农业大学
地址：110866 辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号
国籍：CN
代理机构：厦门福贝知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：郝学江
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