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凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光素（FITC、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
与FITC 的绿色荧光信号相比，FITC的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用FITC作为荧光标记探针。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、试剂盒组份三、操作步骤1．用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；2．用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~5×105细胞；3．吸取250μL的2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；4．用上述500μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；5．加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；6．避光室温反应5min；根据不同的分析方法选择步骤A或B。
A．荧光显微镜观察1．滴一滴经过步骤1~6处理过的细胞悬浮液于载玻片，并用盖玻片盖上细胞；2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；（1）将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；（2）用PBS洗涤细胞两次；（3）吸取250μL 的2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；（4）加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；（5）将（4）步骤的溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；（6）避光室温反应5 min。
凋亡操作步骤Annexin V-FITC／PI法检测细胞凋亡1.将细胞收集到离心管中，1000rpm离心10min，除去上清，用4℃预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心10min，再重复一次，最后除去上清；2.在冰浴上，加入500μl的上样缓冲液到离心管中，用吸管吹打使细胞重悬，然后转移到1.5ml EP管中；3.先加入5μl AnnexinV-FITC，振荡均匀后4℃避光孵育15min，然后再加入5μlPI，同样孵育5min；4.孵育后立即上流式细胞仪分析。
注意：●需制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：a.没有染色的细胞；b.经过处理，仅用AnnexinV-FITC染色的细胞；c.经过处理，仅用PI染色的细胞。
●理想样品浓度调至105-106 cells/ml，一般实验只需0.5 ml的样品。
周期操作步骤1.细胞培养●药物作用后，将细胞胰酶消化，轻轻吹打下细胞至15ml离心管。
●1000 rpm×5 min离心，弃上清。
2.细胞固定●加入3ml 预冷PBS重悬细胞，1000 rpm×5 min离心，弃上清。
●加入500ul PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，在V ertex上低速涡旋震荡（1档），逐滴加入到1.5 ml 100%乙醇（4℃），使其终浓度为75% ，4℃放置过夜固定。
（注意：这里是细胞悬液逐滴加入到100%乙醇中）3.细胞标记●取出固定的样品，1000 rpm×5 min离心，弃上清。
●加入3 ml预冷PBS重悬细胞，1000 rpm×5 min离心，弃上清，收细胞。
●加入150 μl RNaseA（250 μg/ml PBS稀释）重悬细胞，37℃消化30分钟。
●加入150 μl PI（100 μg/ml ,PBS溶解），4℃避光染色30分钟。
●转至流式检测管，分析细胞DNA含量的变化及细胞周期。
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。
以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。
注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。
操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。
第1页，共3页ANNEXIN V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书注意：本产品试剂浓度发生变化，使用前请仔细阅读说明书。
货号：CA1020规格：20T/50T /100T保存：2-8°C ，避光保存，有效期1年。
产品说明：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。
PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。
Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。
因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS 。
PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
因此，可以采用Annexin V 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。
操作步骤:1.细胞样品的准备：a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。
用不含EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。
再次收集到离心管内。
1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
加入约1ml 4℃预冷的PBS ，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。
对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。
AnnexinV-FITCPI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作说明细胞凋亡是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
在细胞凋亡过程中,细胞内膜的磷酯酰丝氨酸外翻到细胞外膜,而Annexin V(膜联蛋白V)对其有天然的高亲和能力,故可以用FITC标记(绿色荧光)的Annexin V来检测细胞凋亡,但本方法的缺点是不能区分早期和晚期的凋亡细胞。
早期和晚期的凋亡细胞的一个重要区别在于细胞膜的完整性(凋亡早期细胞没有丧失膜的完整性),故可以用碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)来染色加以区分。
图源：网络Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒特点：1. 即开即用,不需要专门花时间准备各种成分。
2. 整合了Annexin V-FITC和PI检测法的优点,提高了凋亡细胞检测的灵敏度和特异性,本方法是目前极为灵敏的细胞凋亡检测方法。
3. 跟流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测兼容。
Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作步骤：(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体1、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp 或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
一文掌握AnnexinV-FITCPI细胞凋亡实验方法一、技术原理细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。
细胞凋亡受凋亡相关基因调控，故又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。
一般来说，凋亡早期，主要涉及胞内一些蛋白的变化，例如蛋白量的增高、位置的迁移、状态的改变等，还有一些磷脂、Ca2+的变化等；中晚期则伴随着DNA的断裂、凋亡小体的形成；而细胞形态的改变则伴随着整个凋亡过程。
二、产品应用目前可以采用单染色法和双染色法对细胞进行染色，流式细胞仪检测或荧光显微镜观察来检测细胞凋亡，其中Annexin V/PI法是当下较为流行的检测细胞凋亡的方法。
正常细胞中，磷脂酰丝氨（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生；碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。
因此将Annexin-V 与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。
Apoptosis-AnnexinV 检测示意图碘化丙啶PI检测示意图三、使用方法1悬浮细胞，2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎，造成假阳性，过短，细胞黏连影响检测)最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液，加入细胞培养液终止消化，，2000rpm离心5min收集细胞；24℃预冷PBS，洗涤细胞2次（2000rpm x 5min）,收集细胞2～5×105 ；3离心弃上清，加入500μL结合缓冲液，轻轻吹打重悬细胞；4加入5μL Annexin V-FITC，轻轻吹打混匀，加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。
annexin v-fitc细胞凋亡检测原理Annexin V-FITC（荧光素I同型体）细胞凋亡检测是一种常用的流式细胞术，用于检测细胞凋亡的早期事件。
该方法基于细胞表面的磷脂酰丝氨酸（PS）的外露，这是许多凋亡细胞的特征之一。
Annexin V是一种结合于PS上的蛋白质，它与FITC标记结合后，可以通过流式细胞仪检测到荧光信号。
以下是Annexin V-FITC细胞凋亡检测的基本原理：1.PS外露：在细胞凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸（PS）会从细胞内层翻转到胞外层，暴露在细胞表面。
这一步骤是凋亡的早期事件之一，通常在细胞膜破裂之前发生。
2.Annexin V的结合：Annexin V是一种蛋白质，具有高亲和力与PS结合。
在细胞表面的PS外露后，Annexin V能够结合到PS上形成Annexin V-PS复合物。
3.FITC标记：Annexin V-FITC是一种带有荧光素I同型体（FITC）标记的Annexin V。
FITC是一种荧光标记，可以通过流式细胞仪检测。
4.流式细胞仪检测：经过Annexin V-FITC标记的细胞在流式细胞仪中被激发，FITC会发出荧光信号。
通过检测FITC的荧光信号，可以识别PS外露的细胞，从而确定细胞是否经历了凋亡。
通过Annexin V-FITC细胞凋亡检测，可以将细胞分为四个主要类别：活细胞（Annexin V-FITC和PI均阴性）、早期凋亡细胞（Annexin V-FITC阳性、PI阴性）、晚期凋亡细胞（Annexin V-FITC和PI均阳性）和坏死细胞（Annexin V-FITC阴性、PI阳性）。
这种方法常用于研究药物诱导的细胞凋亡、细胞毒性等生物学过程。
流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断一、原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。
二、步骤：1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。
用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。
待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。
重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。
将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。
2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。
3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，混匀后室温下避光孵育15min，然后再加入400ul的1×结合缓冲液。
整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
4、反应完毕后尽快在一小时内上机检测，用FL1通道检测FITC- Annexin V荧光，FL2通道检测PI荧光。
（Annexin V－FITC）/ PI双染法检测肿瘤细胞坏死及凋亡情况：原理：细胞膜组分磷脂酰丝氨酸（PS）在正常情况下位于细胞膜内侧，当细胞坏死或凋亡时，则迁移至细胞膜外侧。
磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。
荧光素FITC 标记的Annexin V 可以作为探针检测暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸，指示坏死或凋亡的细胞。
FITC-Annexin V结合到细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光。
碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染，而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞则不会有红色荧光产生。
联合应用Annexin V-FITC和PI对培养体系中的细胞进行染色，Annexin V(-)/PI(-)代表健康活细胞，Annexin V(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，Annexin V(+)/PI(+)代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，后两者之和即为受损细胞总量。
步骤：1．如上法构建杀伤体系靶细胞0.5ml、效细胞0.5ml，分别加入24孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中分别孵育3h、6h、12h；2. 把杀伤体系中的细胞培养液吸出至一合适离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞）；3. PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞，室温孵育至轻轻吹打可以使细胞吹打下来时，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度；4. 加入收集的细胞培养液，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，1000g 离心5min，弃上清，用1ml PBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于1×105），然后1000g离心5min，收集细胞；5. 加入400μl 1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞；6. 加入5μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 min；7. 加入10μl PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5min；8. 在30min内进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。
Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。
以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。
注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。
操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。
细胞生物学实验FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞一、实验目的a)了解凋亡细胞的变化及检测方法。
b)了解FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞的原理及方法。
二、实验原理a)细胞凋亡是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀（cell suicide）。
膜磷脂酰丝氨酸原来位于细胞膜的内部。
在细胞凋亡早期，细胞膜上的膜磷脂酰丝氨酸外翻与AnnexinV结合，使其被染成绿色。
在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，使得PI进入细胞当中与DNA结合，使其被染成红色。
b)细胞坏死（cell necrosis）：是由外部化学、物理或生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀（cell murder）。
c)喜树碱（ camp tothecin， CPT）是一种植物来源的抗肿瘤药物，可诱导肿瘤细胞凋亡。
d)Annexin V是一种可与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）特异结合但不能通过正常细胞膜的物质。
碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一种发出红色荧光的DNA结合染料，也不能透过活细胞完整细胞膜。
e)细胞凋亡早期，细胞膜PS由膜脂双层内侧转位至外侧， FITC标记的AnnexinV （AnnexinV-FITC）即可与其结合，使细胞膜处呈绿色。
细胞凋亡中晚期，膜通透性变大，PI可进入细胞与核内DNA结合。
f)激光共聚焦显微镜（LSCM）以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为点光源.除此之外，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of Cell Apoptosis)一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（ph osphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin -Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、P E）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×） 60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2 ×106/ml，备用。
2．200μl细胞悬液加入1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm 4℃离心103．重复步骤2两次。
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器，可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。
细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制，而在疾病发生时，细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。
因此，对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。
本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。
实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI（胰岛素脱羧酶）Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先，将培养好的细胞分到不同的培养皿中，添加凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡。
凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。
通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。
2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后，使用离心机将细胞沉淀下来，并用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。
然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。
3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中，用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度，并将细胞密度调整到合适的浓度。
4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中，添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。
荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC，它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合，从而可以用于检测凋亡细胞；PI荧光染料用于检测坏死细胞。
5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀，然后在室温下孵育一定时间，通常为15-30分钟。
期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。
6.流式细胞仪检测染色反应结束后，将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，通过流式细胞仪的激光和光电探测器，可以分辨出细胞的荧光和散射信号，从而获得细胞凋亡的信息。
使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试，以确保获得准确和可靠的数据。
细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。
细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。
如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。
细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。
在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。
因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。
Annexin V-FITC / PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒货号: P-CA-201规格: 20Assays / 50Assays / 100Assays / 200Assays产品编号产品名称20Assays 50Assays 100Assays 200Assays Storage P-CA-101 Annexin V-FITC 染色液100 μL250 μL500 μL 1 mL 2~8℃. 避光P-CA-151 Annexin V Binding Buffer(10×) 1.4 mL×2 5.5 mL 11 mL 11 mL×2 2~8°C 碘化丙啶(PI)染色液P-CA-161 100 μL250 μL500 μL 1 mL 2~8℃, 避光说明书一份保存条件2~8℃可保存1年。
Annexin V-FITC禁止冷冻保存。
实验原理Annexin V-FITC/PI 荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，可用于检测悬浮细胞和贴壁细胞的凋亡。
Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸(PS) 有高度亲和力。
当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS) 外翻到膜表面，而被荧光染料FITC标记的Annexin V结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。
由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。
本试剂盒检测喜树碱诱导的Jurkat细胞凋亡效果如下图所示：Jurkat细胞用 5 μM喜树碱（Camptothecin）(左) 或未加药(右) 处理4 h，本试剂盒染色后流式检测。
Annexin V-FITC单阳细胞为早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC和PI双阳细胞为坏死或晚期凋亡细胞，PI单阳细胞为裸核细胞。
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明
1. 对于悬浮细胞：
a. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。
注意：PBS重悬不能省
略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。
b. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
c. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
d. 加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
e. 室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。
可以使用铝箔进行避光。
孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，流式检测细胞凋亡的效果及其验证请参考图1和图2。
初次进行流式细胞仪检测时，建议选择一组适当的细胞参考图2设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染这3个对照。
如果用于荧光显微镜检测，1000g 离心5分钟，收集细胞，用50-100µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。
注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。
用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
2. 对于贴壁细胞的消化后检测：
a. 把细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。
室温
孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。
需避免胰酶的过度消化。
注意：对于贴壁细胞，胰
酶消化步骤很关键。
胰酶消化时间如果过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，从而导致细胞坏死
的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与
Annexin V-FITC的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。
同时，胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA，因为EDTA可能会影响Annexin V与磷脂酰丝氨酸的结合。
b. 加入步骤2a中收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS
轻轻重悬细胞并计数。
注意：加入步骤2a中的细胞培养液非常重要，一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，
另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶。
残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC，
导致染色失败。
c. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195µl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
d. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
e. 加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
f. 室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。
可以使用铝箔进行避光。
孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染
色效果。
g. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，流式检测的效果及
其验证请参考图1和图2。
如果用于荧光显微镜检测，1000g离心5分钟，收集细胞，用50-100µl Annexin V-FITC结合液轻
轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。
注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。
用于
流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也
无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
3. 对于贴壁细胞的原位荧光检测：
注：本方法的优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。
a. (选做)如果条件许可，把细胞培养于24孔板、48孔板或96孔板内。
在凋亡诱导结束后，用可以对多孔板进行离心的离心
机1000g离心5分钟。
b. 吸除细胞培养液，加入PBS洗涤一次。
如果条件许可，在吸除PBS前1000g 离心5分钟。
c. 加入195µl Annexin V-FITC结合液。
d. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀。
e. 加入10µl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
f. 室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。
可以使用铝箔进行避光。
g. 随即在荧光显微镜下观察，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光。
注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。
图一
图二。
