医学微生物学实验 抗酸染色+标本片

抗酸染色检查的原理和方法
抗酸染色检查是一种用于检测酸杆菌的方法，特别用于检测结核杆菌。

它的原理是利用染色剂对细菌细胞壁中的酸性成分进行染色，通过显微镜观察染色后的细菌来进行检测。

具体方法包括：
1. 准备标本：收集待检的样本，如痰液、尿液等，可选择直接或间接涂片法。

2. 固定染色：将标本制成涂片，然后固定在加热后的玻璃片上，通常使用95%乙醇、甲醛等固定剂进行固定。

3. 染色处理：将固定后的标本涂片进行染色处理。

通常使用的抗酸染色法有神经酸染色法、济南中国红染色法和抗酸染色法等。

4. 洗涤：将染色后的标本涂片用清水洗涤，以去除多余染色剂。

5. 干燥：将洗涤后的标本涂片在空气中自然晾干。

6. 观察：将干燥的标本涂片放置在显微镜下进行观察，通过放大镜放大视野，并使用油浸镜头进行观察，寻找染色后细菌的存在。

通过观察染色后的细菌形态和染色情况，可以确定是否存在酸杆菌或结核杆菌等细菌。

这种方法可以有效地检测出结核病等疾病的感染。

微生物抗酸染色步骤如下：
1. 准备试剂：选择合适的载玻片，用9%的冰醋酸溶液浸湿载玻片。

用无菌操作取瑞氏染液、美蓝染液、无菌生理盐水，分别滴加到染色槽中，确保每个槽中液体的高度占据染色槽的2/3。

2. 涂片：采取标本时，应使用无菌操作取少量标本放入无菌离心管中，加入少量的无菌生理盐水，振荡离心管使标本充分溶解。

用吸管吸取少量的溶解标本均匀涂布在载玻片上，注意应避免标本在载玻片上形成气泡。

3. 抗酸染色：用竹镊子将涂有标本的载玻片拿起来，先加入少量美蓝染液，盖上盖玻片，避免染液进入对下步观察产生干扰。

用同样方法加等量无菌生理盐水洗去染液后，再滴加少量瑞氏染液，迅速用滤纸吸去多余染液。

4. 镜检观察：染色后，待染色液稍干后，用显微镜观察染色情况。

如果是抗酸阳性杆菌，则会被染成蓝色或淡蓝色；而其他革兰阴性杆菌则会被染成红色。

微生物抗酸染色主要用于区分抗酸杆菌和其他革兰阴性杆菌，尤其是在结核病诊断和疫情监测中具有重要意义。

不同微生物的抗酸染色结果可能会因为菌种的差异而略有差异。

具体操作时应注意无菌操作和染液的配制方法，以及涂片、染色和观察的技巧。

以上内容仅供参考，建议到正规医疗机构进行咨询，获取更全面和准确的信息。

抗酸染色实验报告
实验目的：研究抗酸染色方法对细菌染色的效果，并分析其原理。

实验原理：
抗酸染色是一种特殊的染色方法，在染色过程中可以抵抗酸脱色剂的侵蚀，可以将细胞内的染色物质染上一种特定的颜色，而不会被酸脱色剂去除。

这种方法主要应用于细菌和酸性细胞壁的染色。

实验步骤：
1. 备好细菌培养物样本，使用棉签或细菌环将培养物涂抹在玻璃片上。

2. 将玻璃片固定在火焰上预热的载玻片架上。

3. 将预热的染色盘中加入大量的抗酸染色液(如抗酸红染色液)。

4. 将玻璃片悬浸在染色液中，静置5-10分钟。

5. 将玻璃片从染色液中取出，并用水轻轻冲洗。

6. 在玻璃片上滴加少量脱色剂，静置片刻。

7. 再次用水轻轻冲洗玻璃片。

8. 留干后，将玻璃片放在显微镜载片上，并加一滴显微镜油。

9. 用显微镜观察细菌的染色效果。

实验结果与分析：
通过观察显微镜下的细菌染色结果，可以发现染色后的细菌染色部分呈现出红色或其他指定的颜色，而未染色的部分则保持原始的无色状态。

这说明抗酸染色方法对细菌染色效果好，并能够稳定染色部分的颜色，不容易被脱色剂去除。

抗酸染色的原理是在染色过程中，染色物质与细菌细胞结构之间形成稳定的化学键，使得染色物质不易被酸脱色剂去除。

这种染色方法主要适用于带有酸性细胞壁的细菌，如革兰氏阳性菌。

实验结论：
抗酸染色方法是一种有效的细菌染色方法，能够在细菌细胞内染色，并且对染色部分有良好的稳定性。

这种方法的原理是染色物质与细菌细胞形成稳定的化学键，使得染色物质不易被脱色剂去除。

抗酸染色方法主要适用于带有酸性细胞壁的细菌。

抗酸染色法标本片制作注意事项抗酸染色法是一种常用的组织学染色技术，它可以使细胞核染色出深蓝色，而胞质染色出粉红色或红色，从而使细胞核与胞质之间的差异更加明显。

在进行抗酸染色法标本片制作的过程中，需要注意以下几个方面。

一、标本的选择与处理在进行抗酸染色法标本片制作之前，首先需要选择合适的标本进行处理。

一般情况下，可以选择组织固定后的切片作为标本。

在选择标本的过程中，应注意标本的新鲜度和完整性，避免标本受损或变质。

在处理标本之前，需要对其进行适当的处理，以确保标本的质量。

常见的处理方法包括组织固定、脱水和包埋等步骤。

在进行这些处理的过程中，应注意操作的规范性和标本的完整性，避免对组织结构的破坏。

二、染色试剂的配制与储存抗酸染色法的成功与否很大程度上依赖于染色试剂的质量。

因此，在进行标本片制作之前，需要事先准备好各种染色试剂，并确保其质量良好。

在配制染色试剂时，应严格按照标准操作流程进行，避免试剂的浓度和比例出现误差。

同时，还需要注意试剂的保存条件，避免受潮、受热或受光等因素的影响。

三、标本片的制作与染色标本片的制作过程包括切片、贴片和染色等步骤。

在进行这些操作的过程中，需要注意以下几个方面。

1. 切片：在进行切片的过程中，应注意刀片的锋利度和切片的厚度。

刀片的锋利度直接影响到切片的质量，而切片的厚度则会影响到染色的效果。

因此，在切片之前，应先检查刀片的锋利度，并进行必要的修整。

同时，在进行切片的过程中，要保持手的稳定，避免出现抖动或滑动。

2. 贴片：在进行贴片的过程中，应注意标本的平整度和贴片的紧密度。

标本的平整度会影响到染色试剂的渗透和扩散，而贴片的紧密度则会影响到标本的固定和保存。

因此，在进行贴片之前，应先检查标本的平整度，并进行必要的修整。

同时，在进行贴片的过程中，要保持贴片的紧密度，避免出现松动或脱落。

3. 染色：在进行染色的过程中，应注意染色试剂的使用和染色时间的控制。

染色试剂的使用应按照染色试剂的说明书进行，避免使用过量或不足。

抗酸染色的操作及临床应用抗酸染色是一种在临床病理学中常用的技术，用于检测和诊断与酸性染料亲和的微生物，特别是结核分枝杆菌。

这种染色方法被广泛应用于结核病的确诊、治疗监测及相关疾病的鉴别诊断。

下面将详细介绍抗酸染色的操作及临床应用。

操作方法：1. 原料准备：准备好益氏染液、酸酒红溶液、高锰酸钾溶液、酸性酮液、甲苯、绝对醇和脱脂溶剂等试剂和溶液。

2. 标本制备：将待检标本如痰液、尿液、刮片等经过前处理（如离心、加热、电洗等）后涂片制备，并将涂片固定在90摄氏度的焙烧烘箱中固定片上3~5秒钟，然后用冷水洗净。

3. 染色操作：将固定的检测标本涂片用甲苯浸泡2~5分钟，将甲苯吸出后加入酒精脱脂2~5分钟，然后再用绝对醇脱脂2~5分钟，最后用脱脂溶剂脱脂30~120秒。

4. 抗酸染色：将脱脂后的标本涂片完全浸入益氏染液中，保持液面在标本上1~2毫米高，将益氏染液再加热到80摄氏度，静置5~10分钟，待酸性酮为蓝色。

5. 染色反应：用高锰酸钾溶液滴落在标本上，加热到细菌虫红颜色被去掉，再滴落高锰酸钾溶液热到细菌虫红显现为红色。

6. 清洗与固定：倾倒掉多余的染色剂和高锰酸钾溶液，用自来水彻底冲洗，将标本涂片风干或用吹风机吹干。

7. 反染：将涂片溶于酸酒红溶液中，温和地与酸酒红反应。

反应结束后，再次用自来水冲洗，风干，镜片上缀油。

临床应用：1. 结核菌检测：抗酸染色是诊断结核病的重要手段之一。

通过检测患者痰液、刮片等标本中的抗酸染色-阳性颗粒，可以快速、敏感、直观地进行结核分枝杆菌的检测和诊断。

2. 结核病确诊：抗酸染色技术作为结核病的初筛方法，可帮助医生进行早期诊断和治疗。

对于疑似结核病患者，通过抗酸染色检测可快速识别结核菌，指导早期治疗方案的制定。

3. 结核病治疗监测：抗酸染色技术可用于结核病治疗效果的评价和疗程的调整。

治疗过程中，定期检测患者的痰液标本，观察结核菌的存在和培养基的数量，以判断治疗效果并及时调整治疗策略。

细菌染色标本检查方法之抗酸染色法—萋-尼抗酸染色法（1）实验材料①染色液。

石炭酸复红液、碱性美蓝溶液、3%盐酸酒精。

②菌种。

含结核分枝杆菌的痰标本。

③其他。

普通玻片、酒精灯、接种环及显微镜等。

（2）实验方法①涂片a、直接涂片和厚膜涂片。

用接种环挑取约0.01ml脓性或呈干酪样部分痰液，制成10mm*10mm 大小的均匀薄涂片，或取上述标本约0.1ml，制成20mm*15mm大小的厚膜涂片。

自然干燥，火焰固定后，行抗酸染色或金胺“0”荧光染色，镜检。

b、集菌涂片。

І、沉淀集菌法。

取痰液2—3ml，40g/lNaOH1—2倍量混匀。

经103.43Pa高压灭菌20—25min（或煮30min），3000r/min离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片做抗酸染色或金胺“0”荧光染色镜检；П、漂浮集菌法。

取晨痰2—3ml放入100ml三角瓶内，加1—2倍量40g/lNaOH溶液，经103.43Pa高压灭菌20—25min（或煮30min）。

冷却后滴加汽油0.3ml，瓶口盖玻璃纸加塞，塞紧瓶口，置振荡器或手摇振荡10min，再加蒸馏水至满瓶口而又不外溢，静置10—15min，将已编号的洁净载玻片盖在瓶口上，静置15—20min，取下载玻片并迅速将载玻片翻转至浸膜向上，或用接种环取瓶口液面物涂于载玻片上，自然干燥，火焰固定后做抗酸染色或金胺“0”荧光染色，镜检。

②染色a、初染，在已固定的结核分枝杆菌痰标本涂片上放一小块滤纸片，之后滴加数滴石炭酸复红液后，将标本片放在火焰高处徐徐加温，当涂片上液体出现蒸汽时离开火焰（切不可煮沸），待玻片稍冷却后补充染液（以防干燥或玻片断裂），如此维持染色3—5min，待玻片冷却后用水冲洗，甩干。

b、脱色，在涂片上滴加数滴3%盐酸酒精，轻轻晃动玻片，直至无红色液体流下为止，一般作用1—3min，水洗，甩干。

c、复染，滴加数滴碱性美蓝液于涂片上，作用1min后，水洗，甩干。

用吸水纸印干标本片或自然干燥后油镜检查。

抗酸染色步骤及注意事项制片：（1）涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。

拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。

（3）固定：常用高温进行固定。

即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。

要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。

染色：（1）初染：滴加石炭酸复红溶液2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热5分钟，待标本冷却后用水冲洗。

（2）脱色：（3）复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察: 1、油不要滴太多2、在调节焦距的时候要特别注意与载玻片之间的距离不要弄坏工具3、调节时应该从下往上调节4、在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。

5、用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。

如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。

在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。

6、油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。

结果判定:1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野质量控制：每次用卡介苗做阳性对照大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照注意事项：1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热7. 染色时勿使玻片上的染液干燥临床意义：分支杆菌属（结核分支杆菌、麻风分枝杆菌、非典型分支杆菌）、放线菌抗酸染色阳性，可初步鉴定细菌。