水稻根际耐镉细菌的筛选与鉴定_周丽英

自 20 世纪 30 年代日本富山县神通川流域出现 “ 痛痛病 ” 后 , 镉污染已成为全世界极为关注的环境
问题 [1]。镉已被列为联合国环境规划署提出的 12 种 具有全球性意义的危险化学物质之首 , 也被世界卫
* 国家自然科学基金项目 (31070403, 30671220)、福建省自然科学基金项目 (2009J01056)和福建省教育厅基金项目 (JA09084)资助 ** 通讯作者 : 林瑞余 (1968— ), 男 , 博士 , 教授 , 主要从事作物生理生态、化学生态研究。 E-mail: lrylin2004@ 周丽英 (1986— ), 女 , 硕士研究生 , 主要从事生物化学与分子生物学研究。 E-mail: feixuezly@ 收稿日期 : 2011-10-01 接受日期 : 2011-12-28
中国生态农业学报
2012
Chinese Journal of Eco-Agriculture, May 2012, 20(5): 597 603
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2012.00597
水稻根际耐镉细菌的筛选与鉴定*
周丽英 1 叶仁杰 1 李 林淑婷 1 艺1
24 h。再将上述平板上的菌株划线接种于镉浓度为 300 mg L1 的培养基上 , 37 ℃ 恒温箱倒置培养 24 h, 重复 3 次以上操作 , 观察菌落生长情况。经分离与 复筛后得到 3 株耐镉菌株 , 斜面保存于 4 ℃冰箱中 , 待用。 1.2.2 耐镉细菌生长曲线的测定 选择分离纯化后的 3 株耐镉菌株, 以不加镉处理 为对照, 设置 100 mgL1、300 mgL1、500 mgL1 和 取各斜面保存 700 mgL1 镉浓度处理, 测定生长曲线。 菌种 1 支, 挑取 1 环菌落, 接入 200 mL 的牛肉膏蛋 白胨培养液中 , 在 37 ℃摇床上 150 r·min1 培养 12 h, 作为种子培养液。取 50 mL 的三角瓶 , 加入 25 mL 无菌及含不同浓度镉的牛肉膏蛋白胨培养液 , 准确 吸取 1 mL 种子液加入三角瓶中, 于 37 ℃下振荡培养, 培养时间共 136 h, 每 8 h 取样测定其在波长 660 nm 的 OD 值。对浓度较大的菌悬液, 稀释后测定, 使 OD 值 在 0.10~0.65 之间, 以时间为横坐标、OD 值为纵坐标 绘制生长曲线, 各处理 3 次重复。 1.2.3 耐镉细菌的镉吸收特性测定 无菌条件下 , 将斜面保存的菌株转接到牛肉膏 蛋白胨液体培养基中, 37 ℃ 150 r·min1 振荡培养 12 h 后作为种子液。 分别准确吸取各菌株种子液 1 mL 接 入 100 mL 预先灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基 , 培 养基含镉 100 mgL1, 于 37 ℃下振荡培养 24 h, 试 验 3 次重复。取 5mL 培养液 , 11 000 r·min1 离心 10 min, 取 1 mL 上清液用于测定培养基中残余的镉 含量 , 获得的菌体沉淀经双蒸水漂洗 3 次、烘干、 称重后用于测定菌体的镉含量 ; 另取 5 mL 培养液 , 经离心、漂洗 3 次后 , 在获得的菌体中加入 5 mL 双 蒸水 , 以细胞破碎仪按照每超声 6 s 停 9 s 的程序破 壁 140 s 后 , 13 000 r·min1 离心 10 min, 上清液直接 用于测定菌株细胞内镉含量 , 获得的细胞壁沉淀经 烘干、称重后测定其镉含量。镉含量的测定均采用 火焰原子吸收法 [22], 结果以菌体 HNO3-HClO4 消解、 干重表示 ; 菌株的镉富集系数 = 菌体镉含量 / 培养液 镉含量 [23]。 1.2.4 耐镉菌株的电镜检测 将斜面保存的菌株在无菌操作的条件下转接到 液体牛肉膏蛋白胨培养基中, 37 ℃ 150 r·min1 振荡培 养 24 h。取少量菌液加入镉浓度为 100 mgL1 的牛肉 膏蛋白胨液体培养基中, 37 ℃ 150 r·min1 振荡培养 8~12 h。取上述培养菌液 1 mL, 经 5 000 r·min1 离心 , 洗涤 3 次后 , 固定液 (2.0%戊二醛 -0.1 molL1 二甲砷 酸钠缓冲液 , pH 7.2)固定 1 h, 用 0.1 molL1 二甲砷 酸钠缓冲液洗涤 3 次 , 每次 3 min, 1%锇酸固定 0.5 h 后, 用 35%、50%、70%、80%、95%和 100%丙酮脱 水, 每步 3 min。 然后用 SPI-PON812 包埋, 室温放置 2 h 后, 放入 60 ℃烘箱中 2 d, 聚合完成后用 LKB-V 超薄 切片机切片 , 最后经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后 , 在 200 kV 电压的透射电镜下进行观察。 1.2.5 菌株的鉴定 耐镉细菌 DNA 的提取采用 CTAB 法。 取 1.2 mL
Screening and identification of cadmium-tolerant bacteria from rhizosphere soils under rice
ZHOU Li-Ying1, YE Ren-Jie1, LIN Shu-Ting1, LIU Jie1, XIAO Qing-Tie1, LIN Su-Lan1, LI Yi1, LIN Wen-Xiong1,2, LIN Rui-Yu1,2
福州
刘
杰1
肖清铁 1
林素兰 1
福州 350002)
林文雄 1,2
林瑞余 1,2**
(1. 福建农林大学生命科学学院
350002; 2. 福建农林大学农业生态研究所
摘
要
为获得稻田土壤镉污染修复的微生物, 采用培养基加镉平板法, 从水稻根际土壤分离耐镉细菌。 本研究
分离得到 3 株耐镉菌株, 经 16S rDNA 测序、比对, 鉴定为假单胞菌属细菌。对菌株细胞形态的电镜观察、菌株 生长曲线的测定结果表明, 在镉处理浓度为 100 mgL1 条件下, 菌株生长未受明显抑制, 但菌株形态发生了适应 性的变化; 在镉处理浓度超过 300 mgL1 时, 菌株生长受到明显抑制; 在镉处理浓度 700 mgL1 条件下, 菌株仍 能生长, 但生长延滞期延长, 对数期后的生长量亦低; 对菌体镉含量分析表明, 在 100 mgL1 镉处理下, 3 株菌株 菌体中的镉含量分别为 9.04 mgg1、4.96 mgg1 和 28.58 mgg1, 富集系数依次为 90.4、49.6 和 285.8。可见, 分 离得到的 3 株菌株具有较强镉耐性和镉吸收能力, 将为稻田土壤重金属镉污染的修复提供重要微生物资源。 关键词 水稻 根际土壤 镉污染 细菌 中图分类号 : Q93-331 文献标识码 : A 测序 生长曲线 生长量 文章编号 : 1671-3990(2012)05-0597-07
(1. School of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Institute of Agro-ecology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
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第 20 卷
生组织确定为优先研究的食品污染物。镉不是人体 的必需元素 , 但极易通过食物、水和空气等途径进 入人体并蓄积。已有一些研究表明 , 镉对人体的毒 害极大且治疗极为困难 [24]。 土壤污染是镉毒害的重 要途径之一 , 镉污染土壤对动物、植物都有不同程 度的危害 [57], 建立土壤镉污染的有效修复方法是 各国学者的研究热点之一 [8]。 当前 , 重金属污染主要 的修复方法有物理修复、化学修复和生物修复 [9] 。 生物修复可分为植物修复和微生物修复 [1011], 其中 微生物修复主要是利用某些微生物对重金属的吸 收、沉淀、氧化还原等作用降低重金属毒性 [12], 该 修复技术操作简单、成本低、效果好 , 具有广阔的 应用前景 [13] 。筛选潜在的修复微生物 , 揭示其修复 机理 , 成为相关研究的重要内容。 Hassan 等 [14]已从 重金属污染的河泥中分离出能耐受较高水平 Zn2+和 Cd2+的 Pseudomonas aeruginosa CMG103, 也有人在 铜绿假单胞菌中发现重金属的抗性基因 [15], 恶臭假 单胞菌对镉和铜等重金属有一定的吸附作用 [16], 杨 玉楠等 [17] 发现一些可去除铁、锰的氧化细菌 , 孙长 江等 [18] 筛选出对铁、镁、锰、铝、铬和银等都有耐 性趋磁细菌 , 以及耐镉、铬、钴的芽孢杆菌属细菌 等 [19], 这些研究均为重金属污染的微生物修复提供 了重要资源。但是目前大部分相关研究还处于实验 室阶段 , 有关这些微生物修复重金属污染的应用报 道还较少。本研究从耐镉水稻的根际土壤中分离耐 镉细菌 , 以期通过进一步的开发利用 , 为解决稻田、 稻米镉污染问题 , 实现稻米安全生产、提高人们健 康水平和农田可持续经营提供保障。
Abstract
To identify the bacteria for remediation of cadmium contaminated paddy soils, a plate method (with cadmium in culture
medium) was used to screen cadmium tolerant bacterial strains in rhizosphere soils of rice. Three cadmium-tolerant strains were screened and classified as Pseudomonas sp. by using 16S rDNA sequence analysis. While microbial cell morphology observations (using electronic microscope) and growth curve determinations indicated no significant inhibition effects on growth rates of the three strains under 100 mgL1 cadmium treatment, some adaptive morphological changes were noted. For over 300 mgL1 cadmium treatments, growth rates of the strains were obviously inhibited. Nevertheless, the three strains were tolerant to cadmium concentrations as higher as 700 mgL1 for long periods up to stationary phase. However, growth rates lowered after logarithmic growing phase. Chemical analysis showed that cadmium contents in the bacterial strains under 100 mgL1 cadmium concentration were 9.04 mgg1, 4.96 mgg1 and 28.58 mgg1 by dry-weight. The corresponding enrichment coefficients were 90.4, 49.6 and 285.8, respectively. It then suggested that all the three strains had stronger tolerance and absorption abilities of cadmium. This was an important potential microbial resource for remediation of paddy soils contaminated with cadmium. Key words Rice, Rhizosphere soil, Cadmium contamination, Bacteria, Sequence analysis, Growth curve, Growth rate (Received Oct. 1, 2011; accepted Dec. 28, 2011)