实验五色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的紫外吸收光谱分析一、实验目的1. 掌握紫外-可见分光光度计的工作原理和基本操作。
2. 掌握紫外-可见吸收光谱的绘制（包括导数光谱）以及定量测定方法。
3. 掌握。
4. 了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱特点。
二、实验原理1. 紫外-可见吸收光谱法测定蛋白质含量的基本原理紫外-可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法，也称作紫外和可见吸收广度法，它包括比色分析法和紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。
电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。
当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。
图1 电子跃迁示意图物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度(A),然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。
当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I。
与透过光强度I之比的对数与该物质的浓度c及样品池厚度b成正比。
其数学表达式为:此式为Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基础，其中A为吸光度。
由于不同物质具有不同的分子结构，对不同波长的光会产生选择性吸收，具有不同的吸收光谱，因而，我们可以利用紫外-可见吸收光谱法对物质结构进行鉴定和进行定量分析、根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围(150~800nm)单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法。
氨基酸(amino acid)：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是蛋白质的基本组成单位。
氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。
20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区均有光吸收，而在近紫外区(220nm-300nm)只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸分别是色氨酸(Try)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)因为它们的结构均含有芳香共轭π键系统。
苯丙氨酸最大吸收波长在259 nm、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279 nm,蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280 nm波长处，故我们能够利用紫外-可见分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。
图2 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸结构式2. 紫外-可见分光光度计基本构造荧光分光光度计主要有五部分组成：光源、单色器、样品室、检测器、信号处理和读出装置。
(1) 光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区: 钨灯作为光源，其辐射波长范围在320-2500nm。
紫外区:氢、氘灯，发射185~400 nm的连续光谱。
(2) 单色器从连续光谱中获得所需单色光的装置。
①入射狭缝: 光源的光由此进入单色器;②准光装置: 透镜或返射镜使入射光成为平行光束;③色散元件: 将复合光分解成单色光; 棱镜或光棚;④聚焦装置: 透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝;⑤出射狭缝。
的单色光，作为激发光源，激发待测物质。
(3) 样品室样品室放置各种类型的吸收池(比色皿)和相应的池架附件。
吸收池主要有石英池和玻璃池两种。
在紫外区须采用石英池，可见区一一般用玻璃池。
(4) 检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。
(5) 信号处理和读出装置与计算机连接，自动处理数据。
三、仪器试剂1. 仪器：UV-2501PC Plus型荧光分光光度计，10 mL带玻璃塞的比色管，0.5mL、1.0mL、2.0mL移液管。
2. 试剂：标准溶液(a)：100 mg/L酪氨酸标准溶液；标准溶液(b)：100mg/L色氨酸标准溶液；标准溶液(c)：1000mg/L苯丙氨酸标准溶液（所有溶液均用去离子水配制）；待测样品：混合溶液。
四、实验步骤1. 紫外-可见光谱溶液的配制(1) 移取标准溶液(a) 2.0ml于10ml比色管中，稀释到刻度；移取标准溶液(b) 1.0ml于10ml比色管中，稀释到刻度；移取标准溶液(c) 1.0ml于10ml比色管中，稀释到刻度；(2) 分别移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml 标准溶液(b)于5个10ml比色管中，稀释到刻度。
2.仪器操作(1) 双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束。
预热15-30分钟。
待仪器稳定后方可使用。
(2) 在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤(1)中各溶液在200~ 350nm波长范围内的吸收光谱。
并记录各标准溶液的λmax。
·(3) 在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤1.(2)中的各标准溶液在λmax处的吸光度。
(4) 在步骤(3)同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。
(5) 对色氨酸、酪氨酸定性分析结果做1至4阶导数。
(6) 观察各阶导数光谱，选取酪氨酸导数光谱为0，且色氨酸导数光谱可取到接近极大值的点。
(7) 在此波长上对各浓度色氨酸标准溶液进行求导测定，绘制标准曲线，计算未知样品中色氨酸浓度。
五、数据处理1. Phe、Tyr、Trp紫外-可见光谱定性分析图3 氨基酸定性分析2. 导数光谱的绘制及分析图4 酪氨酸（红）与色氨酸一阶导数光谱图5 酪氨酸（黄）与色氨酸二阶导数光谱A b s .A b s .图6 酪氨酸（黄绿）与色氨酸三阶导数光谱图7 酪氨酸（黄）与色氨酸四阶导数光谱本实验欲测得样品色氨酸的浓度，因此可选取酪氨酸导数光谱为0，且色氨酸导数光谱可取到接近极大值的点。
观察图像可见各阶导数光谱均有满足上述条件的波长位A b s .A b s .置，考虑到求导次数越多，引入误差越大、精确度越低（峰高越低），我们选择一阶导数光谱进行数据处理。
λmax =221.6nm ①标准曲线的绘制 取之前的一系列浓度的标准样品的光谱，做一阶导数，得到其在221.6nm 出的dA/d λ数值：Y = A + B * XParameter Value Error------------------------------------------------------------ A -2.38095E-4 0.00368 B -0.07479 6.08332E-4------------------------------------------------------------ R SD N P------------------------------------------------------------ -0.99987 0.00509 6 <0.0001A b s .图8 色氨酸标准曲线标准曲线方程：dA/dλ=-2.38095×10-4 -0.07479×（[Trp]/(mg·L-1)）②样品吸光值A x=-0.737，代入计算得样品色氨酸浓度为9.851mg·mL-1六、思考题1. 本实验是采用紫外吸收光谱中最大吸收波长进行测定的，是否可以在波长较短的吸收峰下进行定量测定，为什么?理论上，吸光度在任意波长处都与浓度呈正比，只要满足待测物不被干扰，可以选择任意波长处测定。
但一般选择吸收峰处，因为此处吸光度最大，测量误差小。
2. 被测物浓度过大或过小对测量有何影响? 应如何调整? 调整的依据是什么?浓度过大会超过工作曲线线性范围，浓度过小测量误差会增大。
如果浓度不在线性范围内，要调整待测物浓度，比如稀释或浓缩使其落在线性范围内。
或者也可以选择其他合适波长处测量(浓度高时)。
3. 思考紫外-可见分光光度法应用于蛋白质测量的依据，并设计相应的实验方案，测定奶粉中蛋白质的含量。
双缩脲试剂与蛋白质形成紫色络合物，在540nm处有吸收峰，吸收强度与蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸组成无关。
实验方案: 通过样品3描找出最大吸收峰波长，然后配制奶粉蛋白质标样并作出工作曲线，依据工作曲线和测出的奶粉样本吸光度可以求出奶粉蛋白质含量。
七、实验总结1. 定性分析:由图3可知: 苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸吸收峰波长依次增大，摩尔吸光系数依次增大。
解释如下:在紫外-可见光区域内能发生跃迁的原子团叫生色团，如各种不饱和键，而且吸收峰波长和摩尔吸光系数随共轭程度增加而增大。
不能发生跃迁但和生色团相连可以增大吸收峰波长，增强吸收强度的原子团叫助色团，如羟基，氨基，烷氧基，巯基，卤素等。
图9 三种氨基酸共轭体系三种氨基酸均具有苯环、吲哚环等大的不饱和基团，其中具有吲哚基团的色氨酸的不饱和键数量及其面积最大，故发生红移，具有最大的吸收波长，大于苯丙氨酸和酪氨酸的波长(苯丙氨酸有4 个共轭双键,而色氨酸有5 个共轭双键); 而酪氨酸中的羟基存在给电子共轭效应，其相对苯丙氨酸发生了红移，最大吸收波长也大于苯丙氨酸。
从共轭角度看，体系的共轭度增强，波长红移。
对于吸收强度，因为共轭体系J一t*跃迁所产生的吸收带的吸收强度大，摩尔吸收系数emax-10000L.moll.cm:1，.三种氨基酸均有I- n*跃迁，而酪氨酸还有n- J*跃迁(不过这种跃迁的吸收强度小),所以最大吸收峰处的吸收强度苯丙氨酸较小，但总体差别不大，2. 实验总结紫外吸收光谱法是化学与材料学科制备表征物相的基本表征手段之一。
实验原理较简单，操作也较轻松通过紫外吸收光谱法定性测出了氨基酸的最大吸收波长，定量分析了氨基酸的浓度。
下面是本实验的一些经验教训与体会:(1) 标准溶液一定要配制准确，保证工作曲线上的点在一条直线上;(2) 测量时比色皿要用蒸馏水和待测溶液润洗，否侧会出现较大偏差;(3) 在测量前应将机器预热半小时，用蒸馏水校零后再开始测量;(4) 紫外吸收法有许多优点: 方法操作简便、迅速、不需要复杂和昂贵的设备，不消耗样品，测定后仍能回收使用，低浓度的盐和大多数缓冲溶液不干扰测定; 但缺点是紫外区干扰物质多: 且对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差;。
