DNA的复制

第十章 DNA的复制第一节 DNA作为遗传物质的证据DNA作为遗传物质是在发现核酸70多年以后才被证明的1944年Avery等著名肺炎球菌转化试验肺炎双球菌有两种类型：一种是S型细菌，有多糖类的荚膜，是有毒性的，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡另一种是R型细菌，无多糖类的荚膜，是无毒性的，注入小鼠体内后，小鼠不死亡a将活的有荚膜的S型细菌注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡b将活的无荚膜的R型细菌注入到小鼠体内，小鼠不死亡c．加热杀死有荚膜的S型细菌后，注入到小鼠体内，小鼠不死亡d将已杀死的S型细菌与无荚膜R型细菌混合后，注入到小鼠体内，小鼠却死亡了无毒性的R型细菌与已死的有毒性的S型细菌混合后，可以转化成有毒性的S型活细菌究竟是什么使R型细菌转化成为S型细菌的呢？e从加热杀死的S型细菌提取DNA可使R型菌株注入到小鼠体内，小鼠却死亡了DNA样品中微量残留的蛋白质?用蛋白酶处理DNA样品，不破坏转化活性用DNase处理则可使DNA失去这种活性1952Alfred D．Hershey MeathaChase提供了DNA携带遗传信息的第二个证据他们用放射性磷和放射性硫的示踪法噬菌体感染大肠杆菌细胞时病毒的复制制备两份相同噬菌体T2颗粒a用放射性同位素３２P标记噬菌体的DNA b: 用放射性同位素３５S标记噬菌体的蛋白质接着用这两份标记病毒颗粒分别感染未标记的细菌悬浮物感染了噬菌体的细菌细胞置切碎器中搅拌，以便病毒衣壳离开细菌用离心法使空病毒衣壳与细胞分离发现感染了32P标记噬菌体的细胞含32P，表明病毒DNA已进人细胞而病毒蛋白质外壳不含放射性；用同样方法处理感染了用35S 标记的病毒的细胞发现不含放射性，但病毒衣含35S用带３５S的噬菌体侵染细菌，产生的新的噬菌体都不带标记噬菌体侵染细菌，产生的新的噬菌体带标记用带32p的T２第二节DNA复制一、中心法则1958年，F.Crick提出中心法则，揭示了生物体内遗传信息的传递方向：（1）以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程。

（2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分子的过程。

（3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。

二、DNA的复制的一般规律DNA的复制方式（半保留）DNA的复制方式是半保留的双螺旋DNA的每一条DNA链作为模板复制一条新链，产生两个子代DNA分子都含一条新链、一条旧链与之相对是全保留：由复制产生的新合成的DNA链组成双螺旋分子，而亲本双链得以保留半保留复制由Watson和Crick提出，由MathewMeselson和FranklinStahl 1957年证实。

将大肠杆菌在含有15N单一氮源中培养了很多代，从这种细胞中提取的DNA都是重DNA把这种大肠杆菌细胞转移到仅含14N的培养介质中，使所有细胞增殖一代，从这种细胞中提取的DNA都是仅形成单一的带（15N 链和14N 链的杂合双链）让细胞在14N介质中增殖两代，所提取的DNA可分离成两条带，一条带是杂合双链DNA，另一条带DNA则完全是由轻链组成结论：DNA复制是半保留的，而不是“全保留”的。

与全保留复制的假设相抵触：一代：DNA是完全含15N 重链带和完全含14N的轻链带两代：没有完全由15N组成的全“重”链思考题：如果让细胞在14N介质中增殖三代，所提取的DNA情况怎样？（二）、DNA复制的起始点和方向1．DNA双链复制前是完全解开？John Cairns 大肠杆菌3H胸腺嘧啶的培养介质大肠杆菌细胞的DNA带上放射性标记极小心分离DNA，把它们展开在照相底片乳胶上DNA分子的痕迹留在底片上现象：大肠杆菌染色体DNA是一个巨大的环形分子复制过程中的Ecoli DNA多出额外的环使分子呈现θ型结构结论：DNA复制是边解开双链边复制的2．一个方向还是朝两个相反方向同时进行?含3H-胸腺核苷的介质中短时间培养E．coliDNA分子的两个复制叉向相反方向移动复制叉(replication forks)：复制中的DNA在复制点呈分叉状，这种分叉点称为复制叉3．DNA是否从固定的起点开始复制？Ross Inman, 变性作图的方法48502 bp λ噬菌体A=T 单链的泡状原点(origin)：DNA的复制起始点称原点。

大肠杆菌染色体DNA只有一个复制原点，在遗传图上称为oriC。

（三）、DNA的复制是半不连续的DNA新链合成的方向总是DNA链5'→3'则模板链被阅读时是从3'→5'两DNA亲本链方向相反其中一条链的方向是3'→5'方向，而另一条链则是5’→3’方向，两条模板上的DNA合成如何进行?日本冈崎(Okazaki) 复制叉上一条新链是以片断的方式合成的，这种片断被称为“冈崎片断”最终证明：在DNA复制叉上一条新链是连续合成的，另一条新链的合成则是不连续的连续合成的新链称为前导链(1eading strand)它按5'→3'方向合成，与复制叉的前进方向一致。

不连续合成的链称为滞后链(1agging strand)，它也必须以5'→3'方向合成，合成方向与复制叉移动方向相反。

滞后链上合成的DNA片断长度在真核细胞和原核细胞中是不一样的，从几百个核苷酸残基至几千个核苷酸残基不等。

三、参与DNA复制的酶系统和蛋白因子（一）．DNA聚合酶1955，Arthur Kornberg 寻找合成DNA的酶从500kg 大肠杆菌细胞中分离 500mgDNA聚合酶DNA聚合酶I (DNA polymerase I) (Mr103 000)当时以为这种DNA聚合酶就是负责染色体复制的酶DNA聚合酶I催化合成DNA的过程进行了详细研究基本反应：生长链的末端核苷酸的3'-OH对下一个参加聚合反应的脱氧核苷三磷酸α磷原子发动的亲核进攻，并释放出焦磷酸DNA 廷长了的DNA反应方程式是：其酶促合成的机制对所有DNA聚合酶都是适用的DNA聚合酶I催化DNA生物合成的两个基本规律: 第一需要模板第二需要引物引物(primer):互补于模板链的一个寡聚核苷酸片段。

带有一个游离的3'-OH，与后来的核苷酸残基建立磷酸二酯键, 引物的3'末端称引物末端DNA合成的引物是一小段RNA当一个核苷酸被加接到生长中的DNA链之后DNA聚合酶要么离开模板，要么沿着模板链继续移动，并加接另一个核苷酸酶和模板的解离与重新结合会限制催化反应的速度催化反应的连续性(processivity)：多聚酶不离开模板连续加接一定数量核苷酸的过程称为催化反应的连续性。

不同的DNA多聚酶在连续性上有很大差异有些多聚酶一次只能加接几个核苷酸而有些则能加接成千上万个核苷酸（二）、DNA聚合酶催化DNA合成的精确性大肠杆菌 DNA复制其错误率约1／109～1／1010即加接109～1010个核苷酸才出现一次错误大肠杆菌染色体约有4．7×106个碱基对这意味着染色体DNA复制1 000—10 000次才出现一次错误。

体外的研究：每104—l05核苷酸插入一个错误的核苷酸体内存在一些酶系统对这种错误进行矫正这种矫正错误的机制来自DNA聚合酶本身细胞DNA聚合酶有一个独立的3'一5'外切核酸酶活性如果被加接上去的核苷酸是错误的，已经移到下一个核苷酸残基位置上的多聚酶对下一个核苷酸的加接就会受到抑制，多聚酶中的3'一5'外切酶被激活以除去错配的核苷酸DNA聚合酶的这种活性称“校对”(proofreading) DNA聚合酶的校对活性可提高复制精度100—1000倍（三）、大肠杆菌的三种DNA聚合酶大肠杆菌抽提DNA聚合酶I的活性占全部90％以上不适合于大肠杆菌染色体DNA的复制的证据：1．大肠杆菌染色体DNA复制叉的移动速度是DNA聚合酶I速度的20倍以上（600nt/min）2．DNA多聚酶I的复制连续性相当低在它加接不到50个核苷酸时就和模板解离3遗传学研究证明1969John Cairns DNA聚合酶I基因缺陷株只对导致DNA损伤的试剂有超乎寻常的敏感性但这株菌居然存活着20世纪70年代初发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ表现出高度专一于DNA修复功能DNA聚合酶III是大肠杆菌主要的复制酶1999， DNA聚合酶Ⅳ和V，参与不寻常的DNA修复三种聚合酶性质的比较：DNA聚合酶I: 不是细胞内主要的DNA复制酶在细胞DNA复制、重组和修复中起到修缮工作用由5'→3'外切酶活性赋予的5'→3'外切酶活性与3'→5'外切酶的校对活性不同可被除去蛋白酶N ↓ C 5'→3'外切酶 3'→5'外切酶聚合酶Klenow片断或大片断：用温和的蛋白酶处理，可把5'→3'核酸酶活性除去，剩下的片断仍保留着DNA多聚酶活性和校对活性，它被称为大片断或Klenow片断切口平移(nick translation)：完整DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性能够切除与模板链配对的DNA或RNA片断，并用一条新合成DNA链取代它，这个过程称为----其他DNA聚合酶缺少5'→3'外切酶活性DNA聚合酶Ⅲ每个细胞只有10—20个分子复杂含有起码10个亚基的多亚基酶DNA聚合酶Ⅲ多聚化活性亚基α校对活性亚基εθ亚基与α和ε相连以形成一个核心聚合酶核心酶能进行DNA聚合反应，但只有有限的连续性τ亚基的二聚体将两个核心酶连在一起形成复合物复合物再和由五种蛋白γ2δδ’χφ形成的六亚基单钳安置复合物组装形成14个蛋白亚基(9种亚基)的DNA聚合酶Ⅲ14个蛋白亚基的DNA聚合酶Ⅲ连续性还是太低补加四个β亚基形成全酶后获得的β亚基成对相联形成面包圈形结构环绕着DNA像把钳子每个二聚体和一个核心酶组件(聚合酶Ⅲ)相结合当复制进行时沿着DNA滑动，β滑动钳防止DNA聚合酶Ⅲ从DNA模板上解离使复制连续性增加到超过500 000核苷酸（四）、DNA复制需要许多酶和蛋白质因子除DNA聚合酶外，仍需要20个或更多的酶和蛋白执行不同的任务整个复合物就是“DNA复制酶系统”或“复制体”(replisome)复制酶系统非常复杂，一些主要的酶类：1．解螺旋酶 (helicases)解开双链DNA 需ATP的化学能2．DNA拓扑异构酶解除由于解链使DNA螺旋结构产生的拓扑学张力3．DNA单链结合蛋白(single strand DNA binding proteins，SSB)分开的DNA单链被DNA结合蛋白所稳定4．引物酶(primase)预先合成的短的RNA片断5．DNA 连接酶(DNA lignase)DNA后随链相邻两个冈基片段之间仍留有磷酸二酯键裂口，它最后由DNA 连接酶连接封口，从而使后随链成为一条完整的DNA链四、DNA 复制的阶段性DNA复制可以分成三个阶段：起始、延长和终止其区别在于所需各种酶的不同和所发生的化学反应不同（一）DNA复制的起始（大肠杆菌）复制原点叫做oriC，由245个碱基对组成的这些保守序列的一般排列方式关键顺序：3个13bp的重复顺序和4个9bp的重复顺序DnaA蛋白识别起始点，20个dnaA蛋白各带1分子ATP结合于9bp重复序列，使DNA围绕着复合物转成一圈在HU蛋白的参与下，DnaA蛋白识别并成功地变性三个富含A-T对的13bp重复顺序（开放复合物）在DnaC蛋白的参与下，DNA解螺旋酶（DnaB蛋白）和这个区域发生结合反应，双向解开DNA双链。