real time PCR 数据分析
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real time PCR 数据分析
real-timepcr数据分析
无论所使用的real-timepcr是何种型号，正确的数据分析对于获得有效的实验结果都是至关重要的。这里介绍有关real-timepcr数据分析的知识。
在探讨基本分析过程之前，先了解如何设计一个不好的实验。如果你就是自己设计的引物和探针，那有利于下一步的工作。但是在有些情况下，人们采用出版发行文献上的序列可以更便利。忘记，即便就是出版物提供更多的序列也无法确保可以获得优化的实验结果。而且排印错误的可能性也须要考量在内。所以步入实验室之前采用blast对全部序列展开核实保证他们就是恰当的。下订单前先检察引物和探针的序列和tm值就是实验设计的基本建议。
标准曲线是判断实验质量的重要手段。使用一个已知的模板，pcr产物，合成的寡核苷酸或转录的rna做个标准曲线能够确定pcr的效率，敏感性，动态范围和其他的参数。建立标准曲线时使用od260的模板样本。模板的总量以dna分子的数量来描述，把质量转化为dna含量的公式如下：
（质量（克）*阿伏伽德罗常数）每个碱基的平均值质量*模板的长度。
例如，合成70-mer的单链dna，样本质量为0.8*10?-11gm。代入公式得：
（0.8*10?-11*6.023*10?23molecules/mole）330gm/mole/base*70base。
如果使用双链的模板，则碱基的平均质量为660gm/mole/base。
标准曲线采用的模板含量从1*10?7已经开始已连续吸收7次每次吸收10倍，最终获得10个模板拷贝。这样的浓度有利于获得最低的δrn和最高的ct。用excel画曲线时以模板数量的对数值为x，ct（cyclethreshold）值y轴。标准曲线的计算公式如下：
y=mx+b。y就是ct，m是斜率，x=log10templateamount，b=y-intercept。
用斜率排序出来实验效率efficiency【10?（-1/斜率）】-1。实验效率说我们pcr反应的继续执行情况。鉴别系数r?2就是实际结果和理论值吻合程度，则表示吸收和移液的准确性。y-intercept表明实验的敏感度和模板含量的精确度。
通过已知的模板含量，可以计算合成一定的dna含量需要多少次循环：
n=log（nn）-log（n0）/log（1+e）
nn是n次循环后的模板含量，n0是原来的模板含量，e是实验效率efficiency，n是所需的循环数。 一个轻松实验的斜率就是-3.32，效率efficiency就是100%，y-intercept在33至37次循环之间，r^2就是1.00。如果效率（efficiency）较低，y-intercept较低，这意味著循环已经开始时dna的含量严重不足或须要多走几个循环。可以拒绝接受效率efficiency在95-100%之间的实验结果，但如果
y-intercept大大高于37或低于33，这说明没有准确的查明样本数量。通常偏高的y-intercept值是以低浓度存储，反复冷冻解冻造成样本变性的结果。以标准曲线证实实验有效后，就能把同样的规范用于cdna或rna来优化样本准备。
设备运转后的数据分析建议按照以下的步骤展开。
1.amplificationcurves。
如果没这个曲线或看起来不正常，一定必须查明原因解决问题。首先应当检查染色层（dyelayer）和选定的reporter，貌似直观的方法无怨最为有可能的表述。如果曲线看起来很圆形，可能将就是样本中没荧光剂，或者是加样口显然没样本。具体内容就是那种情况大约在40次循环后就可以查知，化解方法就是调节设备退出那些无知的加样口，并使曲线以求连贯。
2.baseline
所有的real-timepcr都用基线（baseline）在早先的几次循环时去检测背景噪音和荧光剂里的试剂。这样不完备的弧线发生在正式宣布的念出数据之前，大约在第1个至第10个循环之间。如果ct的最低值大于基线的下限，必须调整基线值。通常设置2-3个循环基线的下限高于ct最低值。推论基线设置与否最合适可以观测减倍增曲线（amplificationcurve）y轴(δrn)的线性抒发而不是对数方式，有时对数曲线上貌似较好的趋势在线性图上则能够充分反映出来问题。如果下限过低，可以发生在基线之下很低的ct。调节基线直至曲线的直线部分与基线相若。恰当的调节可以使彩虹状残缺不全的对数曲线消失。同样地，音速的下限可能会过高，也可以观测线性减倍增曲线去介绍。调节基线的影响主要是高ct的样本或高含量的模板，如果必须重复试验，吸收模板2倍就相等于把ct系数发生改变1。
下一步的重点在设置正确的阈值。当所有增扩标定点处于指数级增长阶段，用对数值显示y轴。不太可能设置阈值能适合所有的曲线，一个实验里采用多种阈值只适用于mrna含量低造成δrn非常低的情况。有人认为阈值尽可能比较好，有些分析软件调整阈值造成标准曲线有很高的r^2。还有人认为最精确的ct来源于选择sdm最大的曲率。其实并没有最佳的阈值，设置低造成低ct也许有益于某些情况。样本含量上2倍的差异带来ct值1倍的变化，对效率（efficiency）的影响接近100%。
3.污染掌控（notemplatecontrols，ntc）
确保测试的是样本为不是污染物，建议在正式样本前的加样孔中加入2-3个无模板对照样本。加入正式样本前先封闭对照组，同样准备2-3对照样本在加样完成后加入。这个步骤能发现样本是否被污染及其程度。ntc显示ct值低于40，可以检查增扩曲线来了解详情。如果曲线平稳的增加不存在指数级的提高，或增扩速度很慢，用线性图观察δrn图形。一种情况是下降的rox同时fam不变。另一种是fam上升但rox不变。使用多重试图检查每个加样孔的所有荧光试剂，搞清楚报告的信号和有关染料的关系。如果是轻度污染，可以调节阈值来消除影响或移除有关的加样孔。如果ntc出现指数级增扩，会是先前实验留下的pcr产物造成的。处理方法：用dutp(2’deoxyurindine5’triphosphate)和酶ung(uracil-n-glycosylase)替换dttp。
4.无逆转录掌控（noreversetranscriptioncontrol）
如果real-timepcr用于mrna定量分析，需要评估样本中染色体污染物的总量。加入一个不含逆转录酶的样本（-rt）。如果-rt的结果是阳性的，可以用dnase处理样本去掉主要的污染物但会减低rna的产量，或设计引物/探针跨基因间区，或一直使用逆转录控制。
阳性掌控
阳性控制最好的方法是标准曲线。用它来做量化分析，斜率和y-intercept反映了实验质量。如果不能使用一条人工标准曲线，一条覆盖小段dna或全长rna的标准曲线能反映出实验的效率。如果实验没有增扩效果，把注意力放在试剂和模板可能存在的问题上。
5.实验样本
不同厂商的探针会有不同的表现和不同的最大δrn值，这个差别能从实质上影响δrn。但它们不会妨碍指数级增扩，只要增扩期间在设置好阈值相关数据就可用于分析工作。
有可能发生当rox稳定上升，一些曲线在指数级减扩前就是平行的状况。除了可能将貌似存有减扩的曲线其实就是骗人的。分析软件可以尽其所能处置数据，然而如果δrn大大的高于1，必须轻易猜测没真正的减倍增存有无论曲线看起来如何。
6.cv（coefficientofvariance）
7.定量数据
完成初步的实验和分析后，下一步要决定如何有意义地比对数据。量化mrna和dna的标准曲线有时作为绝对量化的参考。标准曲线允许在质量基础上计算总量未知的样本，但是无论材料浓度的精确性如何，最终结果是相对于一个单位的定义。大部分设备的软件可以按事先指定的单位计算总量，也可按以下的公式：
log10copynumber=ctcy-intercept/slope。
重要的是检验你的试剂能够给出100%的反应效率。没必要指望你的样本里会有一个能给出精确的基因表达测量。有关规范化和相对量化的内容本文不做展开讨论。 8.数据统计数据
实验完成了，数据也分析了，还有什么可做的？还有很多，real-timepcr统计与大量参数有关，如实验过程中的细胞收获，核苷酸，提取技术，逆转录，pcr条件和试剂等情况。使用你的数据之前有必要先进行统计整理。数据的表达取决于实验的目的，如测试受某因素影响前和后的基因表达，正常细胞对比癌症细胞，时间的影响等等。另一类如食物、水、环境中的微生物含量，确认生物芯片、sirna的结果等等。
根据实验的类型，有关数据必须按一定的原则整理有利于读者观测至变化，包含数据含义，标准差，置信区间。有些统计数据用作说读者存有关键性差异的可能性，大多数real-timepcr就是检验假设的结果，有时这些差异很显著统计数据步骤只是走过场。但是生物系统就是不断变化的，不准确的，有时统计数据能够表明数据的排他性。
