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第十章-植物种质的超低温保存PPT课件

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(种子学课件)种子超低温贮藏

(种子学课件)种子超低温贮藏

种子含水量超过HMFL，冷冻到一定 温度，种子死亡。例如，小麦种子含水 量高于26．8％，冷冻到-7℃则发芽率下 降到25％(表2)。根据试验，小麦种子含 水 量 为 5.7 ％ ～ 16.4 ％ ， 在 液 氮 温 度 (196℃) 冷 冻 保 存 24 个 月 之 后 发 芽 率 仍 在 92%～96%，同对照相比没有明显差异。
2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
种子超低温贮藏【优质】PPT文档

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甘油、PEG等，使用冷冻保护剂的量应是足够到有冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。
5.解冻后的发芽方法：液氮保存顽拗型种子难以成功，可能
与保存后的发芽方法不当有关，致使还有生活力的种子在发芽过程 中受损伤或死亡。
超低温贮藏的应用
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u极大地延长储藏种子的寿命， 而不产生遗传变异
从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物 种的作用。（例如红豆杉）
❖ 对于含水量高的种子, 可以采用组织培养与超低 种子超低温贮藏是指利用液态氮(-196℃)为冷源，将种子等生物材 料置于超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢活动处于基本停止状
态，而达到长期保持（种子）寿命的贮藏方法。 科学的贮藏方法可以使种子寿命延长、生活力旺盛, 并且能保证作物出苗早、整齐、健壮; 但是如果贮藏方法不合理, 则种子易霉烂、变 质, 生活力降低, 播种后易造成缺苗、断垄, 给农户带来惨重的损失。 从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物种的作用。
u安全地保存许多植物的花粉、分生组织、芽、愈伤组织和细 胞等。 u利用液氮超低温保存花粉
已经在作物、蔬菜( 包括西甜瓜) 、果树 、花卉苗木、茶树、药材等植物上取得了
一定的进展。 利用液氮超低温保存花粉的一般程序是: 花粉采集→ 花粉干燥→花粉低温预处理→
❖ 超干贮藏 适合于长期保存珍贵稀有种质
在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 在同一植物种中这个临界值有一个不大的变动范围，但是植物种间有明显的差异。 2、外在因素对种子对液氮反应的影响 液氮保存的种子不需要特别干燥，能省去种子的活力监测和繁殖更新，是一种省事、省工、省费用的种子低温保存新技术。
植物细胞组织和器官超低温保存

植物细胞组织和器官超低温保存


低温保存是种质资源短期和中期保存常用的方法。
主要适用再生植株、分生组织培养物的保存
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
2. 干燥保存
将愈伤组织或体细胞胚等培养物，适当干燥失水，移入适 宜的低温下，可成功保存种质。 （1）预处理：将蔗糖浓度增至0.15mol/L或更高，预处理 12-20d。 （2）干燥：包括胶囊化处理（encapasulation treatment） 和脱水处理（desiccation treatment）等方法。 （3）储藏：通常选用0℃以上低温，或室温储藏。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰 晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则 可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻 保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰 点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低 未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损 伤，细胞得以在超低温条件下保存。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
一、限制生长保存
限制生长保存（restricting conservation）是指改 变培养物生长的外界环境条件，限制离体保存材料 的生长速度，使细胞生长降至最小限度，但不死亡， 从而达到延长继代培养时间的目的。
目前使用较多的限制细胞生长的措施有改变培养 环境（如降低培养温度、减少培养瓶内氧气含量、 减少光照等）、提高培养基渗透压、加入生长抑制 剂、饥饿法、失水干燥保存等。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大的 液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不 适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在的 条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0. 1-10℃的降 温速度(一般1~2℃／分较好)。降到-70℃左右，随 即浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196℃。在 这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的时 间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少 到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内结 冰。该方法适用于成熟含有大液泡和含水量高的细 胞。
植物种质的超低温保存

植物种质的超低温保存


在培养基中添加生长延缓剂能有效减缓材料的生长。
a.不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差 异 b.同一种抑制剂应用在不同植物中，要达到抑制 作用而不对植物造成伤害所需要的浓度也有所不 同。 c.在一种植物上有效地抑制剂在另一种植物上则 可能无效。
实验已经证明，利用多效唑可以使玉米、水稻、小麦和马铃 薯等的试管苗生长素率降低，同时移栽成活率提高。利用二 甲基氨基琥珀酰胺酸（B9）、矮壮素（CCC）可以使葡萄试 管苗的转管从3个月一次变为一年一次。如果将低温保存与 一些生长抑制剂配合使用，则效果更佳。
d.材料大小也有影响，太大影响预培养效果，冻 存易受冰晶伤害；太小则切取困难，而且增加切 取时对材料的伤害。 e.如果采用大田生长的植物的芽，最好选择在冬 季取材。因为夏季生长的芽都不耐寒，而经秋冬 季的低温锻炼后，植物体的抗冻能力提高，所以 动机去才有较高的存活率
10.2.2材料的预处理
预处理包括材料的预培养和低温预处理，目的是 减少系孢子油水的含量，使细胞经受低温锻炼， 以有效提高组织活细胞的抗冻能力。 •在冰冻保存前的预培养时常在培养基中加入一些 可以提高材料抗冻能力的物质，如山梨酸醇、脱 落酸、脯氨酸、和二甲基亚砜（DMSO）等，最 常用的方法是增加培培养基中蔗糖的浓度。
• （1）种子保存 目前常用的种质保存方法有以下几类： 特点：传统的种质资源保存的主要方式 种子保存占用空间少，保存期较长 易干燥、包装和运输 因此种子在低温下长期保存是防止良种衰变的一条重 要途径。 但是，随着储藏时间的延长，种子生活力逐渐下降， 而且易受病虫鼠害侵袭。 此外，这种方法对于无性繁殖的种类等不适用。
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10.2.3.2保护剂预处理
配制保护剂时，应该将其溶解在培养基里， 或是溶解在有糖或无糖的水中。为防止对细 胞的渗透冲击，保护剂应在30~60min内逐 渐加入，如用甘油则加入速度需更慢。由于 DMSO有一定毒性，所以预处理应该在0℃ 左右的低温下进行。处理时间也不能过长， 一般不宜超过1h。
(种子学课件)种子超低温贮藏

(种子学课件)种子超低温贮藏

种子含水量超过HMFL，冷冻到一定 温度，种子死亡。例如，小麦种子含水 量高于26．8％，冷冻到-7℃则发芽率下 降到25％(表2)。根据试验，小麦种子含 水 量 为 5.7 ％ ～ 16.4 ％ ， 在 液 氮 温 度 (196℃) 冷 冻 保 存 24 个 月 之 后 发 芽 率 仍 在 92%～96%，同对照相比没有明显差异。
二、不同种类种子对液氮低温反应的差异
根据种子对液氮低温的反应，将种 子分为三种类型(Stanwood，1985)：①忍 耐 干 燥 又 忍 耐 液 氮 的 种 子 (desiccationtolerant LN2-tolerant seed)；②忍耐干燥对 液氮敏感的种子(desiccation-tolerant LN2sensitive seed)'③对干燥和液氮均敏感的 种 子 (desiccation-sensitive LN2-sensitive seed)。
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
表1 不同含水量种子经LN2保存7天后的发芽率（石思信等，1985）
适 合 于 冷 冻 保 存 的 最 高 含 水 量 (high moisture freezing limits，HMFL)就是种子 含水量的临界值。在同一植物种中这个
植物种质资源的保存

植物种质资源的保存


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三、保存方式的利弊
1、 原生境保存和异地保存
弊：需耗费巨大的人力、物力和土地，在实际中很难实施， 而且易受自然灾害、虫害和病害的侵袭，造成植物资源 的丧失。
2、 种质库（种子）保存
弊：1）生活力随储存期的延长逐渐丧失；2）无性繁殖的
植物（如苹果、柑橘等）难于采用种子保存；3）采用
无性繁殖来保持其优良性状的植物（许多果树），用种
第十章 植物种质资源的离体保
存
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概述
一、定义
➢ 植物种质资源（又称品种资源、遗传资源或基因资源）
是指携带各种不同遗传物质的植物总称，包括栽培，野 生及人工创造的各种植物的品种或品系。是生物多样性 的重要组成部分，是选育优质、高产、抗病（虫）、抗 逆新品种的物质基础，是生物技术研究取之不尽的基因 来源。
子繁殖后代会发生变异；4）顽拗型种子植物（芒果、
椰子、油棕等）因其种子不易干燥脱水和低温储藏，不
宜用种子保存或保存难度很大；5）有些植株不产生种
子，如脐橙、香蕉；6）易遭自然灾害袭击而使种质资
源丢失。
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三、保存方Байду номын сангаас的利弊
3、离体保存
是将植物外植体在无菌环境下进行组织培养， 并贮存在各类生长抑制条件下，使其缓慢生长或 停止生长，以达到长期保存的目的，而在需要利 用时可迅速恢复正常生长。
来
葡
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萄
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第三节
植物物种资源的超低温保存
一、物种资源超低保存的发展概况 二、物种资源超低温保存的原理 三、超低温保存的基本程序 四、超低温保存的实例
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一、物种资源超低保存的发展概况
第十章-植物种质的超低温保存PPT课件

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第十章 植物种质的超低温保存
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种质保存的概念
• 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。
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2
种质保存的途径
• 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。
• 种植保存：占地多，管理费用高。 • 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导
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分级冷冻法
两步冷冻法
起始温度
0.1-10℃的 降温速度 -70℃~ -40℃
转移温度
液氮
• 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大 量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞 等）
• 程序降温仪
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分级冰冻法
• 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。
• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
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快冻法
• 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 • 降温速度：每分钟1000 ℃以上。
• 适用对象：
–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。
–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。
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THE END
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– 处理方法：
• 低温锻炼 • 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO
、蔗糖）
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（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
(种子学课件)种子超低温贮藏

(种子学课件)种子超低温贮藏


2.忍耐干燥对液氮敏感的种子
许多果树和坚果类作物如李属、胡桃属、榛属
和咖啡属的植物种子属于这种类型。这类种子 多数能干燥到含水量10％以下，但是不能忍耐40℃以下的低温。例如榛子含水量可降到6％， 冷冻到0～-20℃不失去生活力。但是当温度降低 到-40℃以下种子生活力受损。忍耐干燥对液氮 敏感的种子多数含有较高的贮存类脂(如脂肪等)， 有的种含量高达60％～70％。含油量是否是引 起种子对液氮敏感的因素，尚不清楚。这类种 子的寿命一般少于5年。研究这类种子的保存技 术非常必要。因为这类种子多属于主要经济作
2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
种子超低温贮藏
一、种子超低温贮藏的概念和意义
1.种子超低温贮藏的概念
种子超低温贮藏是指利用液态氮(196℃)为冷源，将种子等生物材料置于 超低温下(一般为-196℃)，使其新陈代谢 活动处于基本停止状态，而达到长期保 持（种子）寿命的贮藏方法。
第十章植物细胞组织与器官超低温保存

第十章植物细胞组织与器官超低温保存

第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
2 . 基本程序 (1) 材料的准备与选择。 (2) 预处理。 (3) 将材料装入试管，并随即插入冰浴中。 (4) 加入0℃预冷的冰保护剂，在0℃(冰浴中)放置30一
45分钟。
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
四、超低温保存的基本设备和程序 1. 主要仪器设备
(1) 用于组织和细胞培养的全套设备； (2) 普通电冰箱； (3)-70 ℃- -80℃的低温冰箱； (4) 程序降温器；
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
(5) 玻璃或塑料试管（5ml 或10 m1），封盖严密， 不进液氮； (6) 液氮; (7) 光学显微镜和紫外荧光显微镜； (8) 分光光度计.
3．冰冻保护剂 迄今，已经报道了多种类型的冰冻保护剂。
常用的是二甲基亚砜(DMSO)、甘油、糖和 糖醇类物质、氨基酸、多肽及聚乙二醇等。 但作为冰冻保护剂的物质应该具备以下特性： （1）易溶于水； （2）在适当浓度下对细胞无毒； （3）化冻后容易从组织细胞中去除。
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
(5) 降温冰冻：
a 直接投入液氮； b 程序慢速(0. 5- 5 ℃／分)降温到液氮； c 慢速降温到预冻温度 (-30 - 0℃)，停留一段时间(1-3小时) 后投入液氮， d 逐级降温后投入液氮， 如：0 －-10℃，5分； -15 ℃, 5分； -23℃, 5分；-30℃，5分；-40℃，5分； -196℃(液氮）
(2)预培养，增加培养基中的糖浓度，提高渗 透压；或在预培养基中加入诱导抗寒力的物质 或冰冻保护剂，如脱落酸(ABA)，山梨糖醇、 脯氨酸及二甲基亚砜(DMSO)等。
第10章 超低温植物种质保存

第10章 超低温植物种质保存

第10章超低温植物种质保存——离体植物器官、组织和细胞的超低温冰冻保存技术.种质保存的常见形式:种子保存;种植保存;离体培养保存;超低温冷冻保存。

第1节抑制外植体生长的离体保存方法1 降温2 降氧3 使用生长延缓剂4 其他第2节超低温冰冻保存技术1 原理在液氮(-196o C)的超低温条件下,细胞的整个代谢和生长活动完全停止.在组织和细胞的超低温储存过程中, 不会发生遗传性状的变异,也不会丧失形态发生的潜能.主要仪器设备用于组织和细胞培养的全套设备；普通电冰箱；低温冰箱；程序降温器；液氮罐；装材料用的玻璃或塑料试管；显微镜；分光光度计；……2 材料的准备和预处理2.1材料的选择生理状态；大小；培养阶段；取材季节；……2.2 预培养和预低温处理预培养：培养基中加入一些能使抗寒力提高的物质,可以提高培养细胞的抗冰冻能力.低温预处理：将选好的细胞等材料放在低温下锻炼数天，可能大大提高液氮保存的存活率.2.3 冰冻保护剂预处理1）冰冻保护剂（冷冻保护剂，抗冻剂）常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖类(山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖等)、脯氨酸等.冷冻保护剂使用的浓度和种类因植物种类不同而异.对许多植物来说,DMSO最佳.DMSO对于培养细胞的适宜浓度是5~8%.2) 保护剂预处理：保护剂配制：可以溶解在培养基里,也可溶解在有糖或无糖的水中使用：为避免对细胞的渗透冲击，加保护剂应慢。

由于DMSO等有毒，冰冻保护剂预处理时必须在0o C下进行，时间一般不超过1h。

许多情况下,几种保护剂混合使用可以减低药剂的毒性,提高细胞的存活率。

可能原因：A、彼此减小甚至消除单一成分的毒害作用;B、使各种成分的保护作用得到综合协调的发展。

3 降温冰冻基本操作3.1 慢冻法在有冰冻保护剂存在的条件下,慢速降温。

通过细胞外结冰,使细胞脱水,直到细胞质的冷冻点.然后转到液氮中.适于不抗寒的植物，及悬浮培养的细胞等。

3.2 快冻法一般是将材料经低温预处理后直接投入液氮.利用超速冷冻使细胞内的水迅速通过冰晶生长的危险温度区。

种质保存(植物组织培养课件)

种质保存(植物组织培养课件)

（六）解冻时，从液氮冰箱中取出安剖瓶，直接放到40℃水 浴锅中，停留1～2min.
（七）将混合液涂在琼脂平板培养基上进行重新培养。 （八）细胞生命活力检查
超 低 温 库
马铃薯限制生长离体试管苗保存技术
（一）试管苗培 养
（二）延长试管 苗保存期
1.培养基中添 加脱落酸和 甘露醇
2.用塑料薄膜 封闭试管口
结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物 材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结 冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到 植物材料保存目的。
植物细胞含水量大，冰冻保存难度大，投放液N2 中易引起组织和细胞死亡，故须借助于冷冻防护剂， 防止细胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏， 保护细胞。
（三）将含有20%脯氨酸的冷培养基分成4份并在1h内 逐渐加入到等量的冷细胞悬浮液中。
（四）将混合液在冰上保存1h后，转移到灭过菌的聚 丙烯安剖瓶中，盖好螺帽（每两个安剖瓶中用移液 枪接入1mL混合液）。
相关实践知识
（五）用可控降温仪以1℃/min的速度将按剖瓶冷却到-30℃， 并停留30～40min后投入到液氮冰箱中进行贮存。
指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质， 使其保持生命力与遗传性的技术。
种质保存的方式
原地保存
异地保 存
原地保存主要通过建立自然保护区、天然公园来实现种 质保存的目的；
异地保存则通过建立植物园、种质资源圃、种子库以及
离体保存等方法来实现。
离体保存的意义
1、可使一些无性繁殖作物种质资源低温长期保存，避免资 源的丢失。
种质库要定期检查，保持清洁， 及时清除污染材料，并注意积累资 料。
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（二）超低温保存 一般以液N2为冷源

超低温冷冻保存种质

超低温冷冻保存 种质
植物种质的超低温保存
超低温冷冻保存种质
• 是指利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有 的遗传物质保持其完整性，有高的 活力，能通过繁殖将其遗传特性传 递下去。
按保存类型分类
按保存类型分类可分为两种类型
非原生境保存
原生境保存
超低温冷冻保存种质
超低温冷冻保存种质
• FDA、TTC等染色的方法进行快速检测， 只能作为生活力的预测指标
超低温保存技术的发展
1973年科学家首次成功地超低温保存 了 胡萝卜悬浮细胞。
1993年，英国国家种质库采用超低温保存 离体的苹果种质进行再培养成功。
超低温冷冻保存种质
• 悬浮细胞和愈伤组织的保存 • 生长点冷冻保存 • 胚状体（体细胞胚、花粉胚）冷冻保存 • 原生质体冷冻保存
超低温冷冻保存种质
a、快速解冻法 指将液氮中保存的材料直接投入到37—40℃
温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度 为500—750℃/min。 b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻， 再逐渐升至室温下进行解冻的方法。
超低温冷冻保存种质
• 检验化冻后材料的生活力和存活率的最 根本方法是再培养。
费用高，易受到自然灾害的影响
超低温冷冻保存种质
优点：占用空间少，无病虫害以及自然灾害 的影响，不受季节限制。短时间可实现大量 植物的增殖，无病毒。
缺点：连续不断的继代培养可能会引起染色 体和基因型的变异。
种质资源超低温保存是将植
物的细胞或组织经过Байду номын сангаас冻处 理后, 在液氮超低温- 196℃ 下保存的方法。
所使用的冷冻保护剂 应具有以下特性：
◆分子质量较小 ◆易于与溶剂混合 ◆快速渗入细胞 ◆无毒或毒性小 ◆易洗脱

植物细胞组织和器官超低温保存


资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
超低温保存的作用及意义
1. 保持细胞培养物的遗传稳定性； 2. 长期保存植物的种质资源; 3. 长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质； 4. 建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无病毒的原种； 5 . 保存实验材料，防止再培养中遗传变异。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
3. 生长抑制保存
采用生长抑制剂或生长延缓剂延缓培养物的生长，延长保 存时间。
如采用3mg/L的ABA使草莓试管苗在25±1℃的常温下保存 12个月，存活率62.5%；延长5个月保存时间。在6±2℃保存 15个月，存活率100%。
常用生长延缓剂有ABA、多效唑（PP333）、矮壮素（CCC） 和比久(B9)和生长抑制剂三碘苯甲酸（TIBA）、烯效唑（S3307）和青鲜素（MH. 高渗透压保存 提高培养基渗透压可以一直培养材料的生长。如在
培养基中添加渗透化合物，如高浓度蔗糖、甘露醇、 山梨醇等。
蔗糖浓度由3%提高到10%左右，可明显抑制培养 物的生长。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
二、超低温保存
超低温保存是指在-80℃至-196℃甚至更低温度下进行 生物材料的保存。在超低温环境下，植物活细胞的代谢和 生长几乎完全停止，植物处于相对稳定的状态，但能保持 正常的活性和形态发生能力，从而达到长期保存的目的， 在适宜的条件下可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原 来的遗传特性。
冷冻保存是将体外培养物或生物活性材料悬浮 在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻 速率降至零下某一温度（一般是低于-800C的超低 温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。
而复苏是以一定的复温速率将冻存的体外培养 物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生 物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可 以进行冻存，并在适当条件下复苏。

十章低温仓库种子ppt课件

3、种子贮藏过程中，种子质量检验的有关监测数 据。
四、技术档案管理
低温低湿库的技术档案每个保管 季节终了以后，必需做好任务总结， 并将资料归档、分类与编号，由专 职人员保管，不得随意丧失。
1、按种子检验操作规程，获取每批种子入 库时发芽率、含水量及主要性状检验资料。
2、种子存贮日期、分量和位置。 3、为寄贮单位存贮种子，双方共同封存样品 资料。
〔三〕搜集与储存以下主要监测信息
1、种子贮藏期间，本地自然气温、相对湿度、 雨量等气候资料。
2、库内每天定时、定层次、定位点的温度、RH 资料。有条件的，将智能温湿度仪与电脑接口衔 接，把信息储存电脑中。
构造。
第二节 种子低温仓库设备和技术管理特点
一、制冷设备 制冷设备主要是制冷机，制冷机主要由四 部分组成，即紧缩机、冷凝器、膨胀阀和蒸 发器。
制冷剂为二氯二氟甲烷，化学分子式为 CHF2Cl2，商品称号为氟里昂12，简写成F12或R-12。制成冷凝机组产品有2F-10，4F10，4FV-10等各种型号。
〔一〕、严厉建立仓贮管理制度 〔二〕、搜集与储存主要种子信息 〔三〕、搜集与储存主要监测信息
〔一〕严厉建立仓贮管理制度
1、种子入库前，彻底清仓，严厉 消毒或熏蒸。
2、把好入库前种子质量关。 3、合理安排种垛位置，科学利用 空间，提高利用率。
4、库室密封门尽量少开。 5、严厉控制库房温湿度。
〔二〕搜集与储存以下主要种子信息
第十章 低温仓库子
第一节 种子低温仓库的根本要求
良好的低温库必需具备以下要求。 一、隔热保冷 二、隔湿防潮 三、构造严密 四、屋顶和仓壁的隔热构造
隔热保冷
是最根本的要求，库内的隔热保 冷性能，直接关系到制冷设备的 任务时间、耗能及费用等方面的

《低温保鲜法》PPT课件


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3、气调保鲜法
将氧气浓度降至1-7%，二氧化碳气体浓度提升到18%，保鲜瓜果色泽鲜艳，品味良好，减少冷害与生理操 作造成的损失。 品种 温度℃ 氧浓度 二氧化碳 保鲜期 好果率 西红柿 24-28 2-5% 3-5% 40天 70%
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4、化学保鲜法
• 采用消毒杀菌剂、生长抑制剂及生物保鲜 剂处理蔬菜，以达到防止蔬菜腐烂，抑制 后熟及生长，防止叶菜褪绿等目的，起到 保鲜效果。
1、低温保鲜法
（5）根茎菜类
– 这类蔬菜呼吸作用与蒸散作用最低，较耐贮藏
在相对湿度85—90％，温度5—15℃的范围 内，可保鲜2—4个月
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2、速冻保鲜法
– 主要用于豆类蔬菜 – 将蔬菜置于－50℃的温度下处理5—10小时，
所有商品都全部冻结后，再转移到–10℃的环 境中贮放 – 极低温度的速冻，能使蔬菜细胞组织在极短 时间内受冻结，酶活性停止，并抑制病原微 生物活动
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四、蔬菜质量控制标准
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五、蔬菜陈列方法
• (一)、圆积型； • (二)、圆排型 ； • (三)、茎排型 ； • (四)交差型(互相配合型) ； • (五)、格子型 • (六)、段积型 • (七)、投入型
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五、蔬菜陈列方法
• (八)、并立型； • (九)、堆积型； • (十)、植入型； • (十一)、散置型； • (十二)、茎积型； • (十三)、围绕型； • (十四)、面对面型； • (十五)、背向型；
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三、蔬菜的上架标准
• （一）蔬菜类的收货标准 • 1、根茎类：茎部不老化，个体均匀，未发
芽、变色。 • 2、叶菜类：色泽鲜亮，切口不变色，叶片
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• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
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快冻法
• 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 • 降温速度：每分钟1000 ℃以上。 • 适用对象：
–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。
–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。
致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 • 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的
技术。应用前景广阔。
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3
一、离体保存方法
• 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。
• 抑制生长的方式：
– 降低温度 – 降低环境中的氧含量 – 使用生长延缓剂 – 其它方法
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离体种质保存的优点
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玻璃化法
• 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 • 影响因素： ✓ 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； ✓ 植物材料的脱水温度和脱水时间。
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（三）基本程序
• 4、化冻操作 • 快速化冻：适用于大多数材料 • 慢速化冻法：适用于含水量较低的材料 • （5、去除冰冻保护剂） • 6、化冻材料的活力检测： • 根本方法：再培养
• 占用空间少，节省人力 、物力和土地； • 便于种质资源的交流利用； • 需要时，可以利用离体培养方法很快大量
繁殖； • 避免自然灾害引起的种质丢失。
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二、超低温冰冻保存技术
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6
（一）原理
• 原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、 生长都停止了，因而排除了遗传性状变异 的可能性，达到长期保存植物种质的目的 。
– 处理方法：
• 低温锻炼 • 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO
、蔗糖）
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（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除。 • 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、 PEG等。
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（三）基本程序
• 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保 持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的 稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的• 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。
• 解决措施：
– 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； – 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； – 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成；
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分级冷冻法
两步冷冻法
起始温度
0.1-10℃的 降温速度 -70℃~ -40℃
液氮
转移温度
• 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大
量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞
等）
• 程序降温仪
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分级冰冻法
• 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。
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（三）基本程序
• 1、材料的选择：
– 组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原 生质浓厚的分生细胞或组织；
– 培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活 率高）
– 大小：适宜
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（三）基本程序
• 2、材料的预处理
– 处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞 经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力 。
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THE END
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第十章 植物种质的超低温保存
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种质保存的概念
• 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。
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种质保存的途径
• 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。
• 种植保存：占地多，管理费用高。 • 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导
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玻璃化法
• 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化 过程。
• 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固 ，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料 一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保 护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中 水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生 结构和体积的改变。