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⼈胰岛素的制备⼈胰岛素得制备⼀、获得⽬得基因从供体细胞中提取mRNA,以其为模板,在反转录酶得作⽤下,反转录合成胰岛素mRNA互补DNA,再以cDNA第⼀链为模板,在反转录酶或DNA聚合酶I得作⽤在,最终合成编码它得双链DNA序列。
即得到了⽬得基因。
反转录-聚合酶链反应法(⼀)从⼈体细胞内提取胰岛素基因转录得mRNA1, 细胞总RNA得提取 :取胰岛B细胞,⽤PBS洗后,加⼊TRIZOL试将细胞破裂,后⽤DEPC处理,多次离⼼后,取RNA⽩⾊沉淀,测OD值,电泳。
2 ,从总RNA中分离mRNA:取上述提取得总RNA若⼲,加⼊Buffer OBB ,Oligotex Suspension ,打匀。
70℃⽔浴(裂解RNA得⼆级结构), 20-30℃条件下,静置(让Oligotex与mRNA结合)。
将Oligotex/mRNA复合物得沉淀加到EP管SPIN柱上⾼速离⼼,加Buffer 将其她RNA洗脱,最后⽤琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。
(⼆)mRNA转录合成cDNA第⼀链cone 第⼀链得合成加⼊上步获得得mRNA与适当引物于EP管中,加⼊RNase-free water,混匀后,70℃反应10分钟,反应完成后,⽴刻将反应体系置于冰上5min;稍微离⼼⼀下,顺序加⼊缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP(加⼊放射性同位素利于检验), 混匀,稍微离⼼反应物之后,42℃放置2分钟。
取出置于冰上。
电泳分析,同位素活性测定。
(三)PCR法扩增,特异合成⽬得cDNA链通过胰岛素得特异引物,⽤PCR法进⾏扩增,特异得合成胰岛素得cDNA 链。
PCR法得操作步骤:预变性引物退⽕引物延伸循环25-35次最后延伸前端引物:5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac caccac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’后端引物:5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’⼆、组建重组质粒采⽤pQE--30质粒作为载体,⽤双酶切法进⾏基因重组。
pET-30a大肠杆菌表达载体, pET-30a质粒，菌株编码名称规格保存条件北京华越洋生物GHT-20MG pET-30a20mg-20℃,避光,12个月北京华越洋生物GHT-100mg pET-30a100mg-20℃,避光,12个月pET-30a大肠杆菌表达载体, pET-30a质粒，菌株载体信息：启动子：T7/lac复制子：pBR322 oripET-30a大肠杆菌表达载体, pET-30a质粒，菌株载体别名：pET-30a,pET30a,pET 30a载体分类：大肠杆菌表达载体载体大小：5422 bp载体抗性：卡那霉素Kan载体标签：N-His, N-S, N-Thrombin, N-EK, C-His筛选标记：克隆菌株：DH5α表达宿主：BL21 (DE3)培养条件：37℃,LB5' 测序引物:T7：TAATACGACTCACTATAGGG3' 测序引物:T7-Ter：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG备注：pET-30a大肠杆菌表达载体, pET-30a质粒，菌株载体简介：The maps for pET-30b(+) and pET-30c(+) are the same as pET-30a(+) (shown) with the following exceptions: pET-30b(+) is a 5421bp plasmid; subtract 1bp from each site beyond BamH I at 198. pET-30c(+) is a 5423bp plasmid; add 1bp to each site beyond BamH I at 198. The pET-30a-c(+) vectors carry an N-terminal His•Tag®/thrombin/S•Tag™/enterokinase configuration plus an optional C-terminal His•Tag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below.操作说明：1.请使用华越洋生物定制开箱器打开外包装；2.该产品包含20μl质粒，可保存在-20℃冰箱中；3.取1μl质粒转化进合适的感受态中；4.大量提取质粒并保存适量的甘油菌，置于-80℃长期保藏；。
常用pGEX载体图谱Rosetta系列的表达菌株可以提供T7 RNA聚合酶，它能表达PET系列载体上的外源基因。
pGEX系列载体上的外源基因不需要T7 RNA 聚合酶，普通的大肠杆菌经IPTG诱导即可表达Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。
其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac 启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成蛋白标签：A myc tag is a polypeptide proteintag derived from the c-myc gene product that can be added to a proteinusing recombinant DNA technology. It can be used for affinity chromatography, then used to separate recombinant, overexpressed protein from wild type protein expressed by the host organism. Itcan also be used in the isolation of protein complexes with multiple subunits.A myc tag can be used in many different assays that require recognition byan antibody. If there is no antibody against the studied protein, adding a myc-tag allows one to follow the protein with an antibody against the Myc epitope. Examples are cellular localization studies by immunofluorescence or detectionby Western blotting.The peptide sequence of the myc-tag is (in 1- and 3-letter codes, respectively):N-EQKLISEEDL-C,N-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu -C, where N stands for Amino-terminus and C stands for Carboxy terminus. The tag is approximately 1202 Daltons in atomic mass and has 10 amino acids.It can be fused to the C-terminus andthe N-terminus of a protein. It is advisablenot to fuse the tag directly behind the signal peptide of a secretory protein, since it can interfere with translocation intothe secretory pathway.A monoclonal antibody against themyc epitope, named 9E10, is available from the non-commercial Developmental Studies Hybridoma BankpGEX4T1载体基本信息出品公司: GE别名: pGEX-4T-1, pGEX4T1, pGEX 4T 1质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体表达水平: 高拷贝启动子: Tac克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4969 bp5' 测序引物及序列: pGEX5': GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG3' 测序引物及序列: pGEX3': CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG载体标签: N-GST载体抗性: Ampicillin 氨苄备注: 复制子是pMB1产品目录号: 27-4580-01稳定性: 瞬时表达 Transient组成型: 诱导表达病毒/非病毒: 非病毒pGEX4T1载体质粒图谱和多克隆位点信息原核生物DNA复制起始点，是DNA链上独特的具有起始DNA复制功能的碱基序列。
构建载体注意事项
1、双酶切时注意挑选的酶切位点，有时识别序列不一样的，酶，在酶切后会产生相同的粘性末端，给试验造成很大的麻烦；
2、注意两种酶工作条件的差异，尽量使用可以同时双酶切的两种酶；
3、在PCR产物末端引入酶切位点时，要注意在引物酶切位点的末端加入保护碱基；
4、PCR产物最好在沉淀之后再进行酶切，怡排除残存的Taq活性的影响；
5、酶切时要注意酶的星活性问题，要控制甘油含量在5％之内（酶中含有50％的甘油，所以加入酶的量不能超过反应体系的1/10）；
6、双酶切入单独进行时要注意酶切的先后顺序，有些酶在末端时酶切效果不好，这时应该先做这个酶切；
7、酶切后要加热（65度10min）使酶失活，有些酶则必须用酚氯仿抽提，切胶回收使比较好的方法；
8、连接使注意载体与片断的比例，一般为片断：载体3－5：1比较好，连接反应体系要小一些（5－10ul）；连接后可直接进行转化，但连接产物的比例不能超过感受态细胞的1/10为佳；
9、在连接时反应体系中氯化钠或氯化钾的浓度不要大于200mM，因为这回抑制ligase的活性；
10、在连接之后进行转化之前应在65度加热10min，这样可以提高转化效率，如是进行电机转化则应用酚氯仿进行抽提；
11、转化时要设对照怡确定转化的效率；。
天津医药2008年11月第36卷第11期脂联素（adiponectin，ADPN）是脂肪细胞特异性分泌的一种血浆激素蛋白，在循环血液中大量存在，约占人体血浆总蛋白含量的0.01％[1]。
人类脂联素基因定位于染色体3q27，全长约17kb，由3个外显子和2个内含子组成，编码244个氨基酸组成的胶原样蛋白。
大量研究证明脂联素在调节内分泌代谢及能量平衡过程中发挥了极其重要的作用，可降低血脂、血糖，改善胰岛素敏感性及拮抗动脉粥样硬化[2]。
在脂联素转基因小鼠中，脂联素的过度表达成为预防糖尿病和动脉粥样硬化的保护性因素，重组脂联素在动物模型中具有抑制内源性葡萄糖产生等作用[3]。
本研究成功构建PQE30/ADPN原核表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究脂联素信号传导机制及其生理作用奠定了基础。
1材料与方法1.1材料大肠杆菌JM109及M15均为本室储存；DNA凝胶回收试剂盒，限制性内切酶，T4DNA连接酶为大连宝生物工程公司产品；质粒PUC57为上海生工生物技术公司产品；表达载体PQE30为Qiagen产品；PCR上、下游引物为本室设计，由上海生工生物技术公司合成及测序；兔抗人脂联素抗体购自Biovem公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG 为武汉博士德生物工程有限公司产品；DAB显色试剂盒购自北京天根生物技术公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2方法1.2.1人脂肪组织总RNA提取及脂联素cDNA的克隆参考文献[4]。
人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达*史晓文刘德敏孙颖张捷摘要目的：构建人脂联素重组表达载体PQE30/ADPN，并在大肠杆菌宿主系统中表达出脂联素蛋白，对表达产物进行鉴定。
方法：将构建好的人脂联素克隆载体PUC57/ADPN与原核表达载体PQE30通过双酶切方法位点特异地连接在一起,再转化入大肠杆菌JM109感受态细胞中。
通过筛选得到含有人脂联素基因的重组载体PQE30/ ADPN，并用IPTG在大肠杆菌M15中诱导表达。
中山大学硕士学位论文谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达姓名：***申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：***20070608半醛（ｓｓＡ）和谷氨酸，然后ＳＳ＾在琥珀酸半醛脱氢酶（Ｓｕｃｅｉｎａｔｅｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，简称ＳＳＡＤｒＩ）氧化下形成琥珀酸进入三羧酸循环，这些反应和谷氨酸脱羧酶（ｇｌｕｔａｍａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＥＣＡ．１．１．１５）催化的谷氨酸脱羧反应一起，构成了Ｙ一酮戊二酸氧化形成琥珀酸的另一条支路（Ｓｔｒｅｅｔｅｒｅｔａｌ，１９７２），称之为ＧＡＢＡ支路（如图１—１、卜２）。
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镕，ｌｇｔ鬻Ｙ－－黧—整鏊麓—㈨谷氯缒Ｉ；Ｉ舔氮毅脱羧醮ｌ‘ｌｌ置蔽联镛拜）骧期蘸辅ｉ跷了一氮蕊Ｔ馥’ｔｉｌ｝泓繁氟酶廷勰索酸—４琥珀麓≮器萄瑟甄萄嚣基毒嘲酸拳蒸图１－１：ＧＡＢＡ支路相关的酶ＩＦｉｇ．１·１：ＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＧＡＢＡｐａｔｈｗａｙＩ图１－２：ＧＡＢＡ支路相关的酶ＩＩＦｉｇ．１—２：ＥｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅＧＡＢＡｐａｔｈｗａｙＩＩ１．２．１ＧＡＢＡ的生理功能（１）改善脑机能，延长记忆力。
研究表明，ＧＡＢＡ可以提高葡萄糖磷酯酶的活性，从而促进动物大脑的能量代谢，活化脑血流，增加氧供给量，最终恢复脑细胞功能，改善神经机能。
（２）改善视觉功能。
据报道，将带有毛细管的电极插入老年猴子的大脑视觉神经皮层中，通过毛细管给神经细胞注入微量的ＧＡＢＡ。
比较给药前后视觉神经细７马倩中山大学硕士学位论文ＧＡＤ６７３４８８ｂｐ图．２．７ＧＡＤ６７的基因结构分析Ｆｉｇ．２·７ＴｈｅｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＡＤ６７马倩中山大学硕士学位论文细菌表达载体ｐＱＥ３０由本室保存。
物理图谱见图３—２。
ｐＱＥ－３０，ｐＱＥ·３Ｔ，ａｎｄｏＱＥ－３２ＶｅｃｔｏｒｇＰｏｓｉｔｉｏｎｓ研’ｅｌｅｍｅｎＩｓｉｎｂａｓｅｓ“ｐＱＥ·３０割０Ｅ－３１ｐＱＥ－３２Ｖ＊ｃｔｏｒ赫｛ｂｐｌ３４６１钍醴＋泓６２跏一ｏｆｎｕｍｂｅｒｉｎｇ耐热ｏｌ（ＣＴＣＧＡＧ）１蠢１－６ｌ毒Ｔ５ｐｒｏｍｏ栅／ｌａｃｏｐ烈司垂ｃ盱ｄｅｍｅｎｔ７－－８７瑚７７迎７ｒＴ５ｔｒｏｒ％ｃｒｉｐｔｉｏｎｓｔａｄ＂６１６１６ｌ６】ｃＨｉｓ－ｔａｇ∞ｄｉｎｇｓｅｑｕｅｍ：枣１２７—１４４他７－１钳１２７－ｔ４４Ｍｕｌ矗ｐｌｅｃ｜ｏｎｉｎｇ钳翻ｅ１４５一１９２１４７－１９４１４｛缸１９３ｈｂ如，Ｂ细ｎ５ｃ打ｐ如ｎｄｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ理赫２０８－－３０２２１０．－３０４２０９－３０３咖８Ｔ１ｔｍｎｓｃｎ两ｏｎａｌｈ冀啊瞄抟ｃｌ｜；ｏｒｒｆｅ叠ｉｏ“１０６４－１１６２１０６６＿１１６４１０６．孓．１１６署Ｃｏｌ￡１ｏ南ｉｎｏｆｒｅｐｌｉｃａｔｍｎ１６３０１６４０１６３９参｛ｑ馥确瞅ｃｏｄｉｎｇｓｅｑ臼ｅｎｃ邑零２Ｓ垂－２３９６９２５＆－２３９８嚣２５７卫３９７叠竺‰燃盛驺§隔∞啼‘图３－２ｐＱＥ３０载体物理图谱、多克隆位点及测序引物占Ｆｉｇ．３－２Ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｏｆｐ０Ｅ３０ｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐ一ｍｄｌ＇ｓ。
⽣物信息学课程复习题（南医⼤）⽣物信息学课程习题第⼀章绪论⼀、填空1、在年，美国国会批准启动⼈类基因组计划，拟⽤年时间测定⼈类全部条染⾊体上共个碱基序列的测定。
2、是遗传信息的携带者。
3、蛋⽩质三维结构测定主要⽅法有和。
4、理想的抗⽣素靶标应为微⽣物细胞所必须，在病原体中⾼度，且在⼈体中或与⼈类基因有。
5、下图例举了⼀个计算机辅助药物设计的实例，从a图中我们得到了配体上R基团附近的受体上有和残基，具有性，因此可以将R基团设计为性基团，如图b中所⽰的基团，使得抑制活性⽐改造前提⾼了近5000倍。
⼆、名词HGP（human genome project），EST（expressed sequence tag）, SNP（single nucleotide polymorphism）,⽣物信息学（Bioinformatics），药物基因组学（Pharmacogenomics），intron，“Junk DNA”，⽐较基因组学，蛋⽩质组学，分⼦进化树（evolutionary tree），基因组，基因组药物三、简答1、简述⽣物信息学在药物研究开发领域的应⽤可体现在哪些⽅⾯？2、如何利⽤基因组信息寻找新的药物作⽤靶标？3、如何利⽤⼈类基因组信息实现个性化治疗，其基于的原理是什么？4、试叙述基因芯⽚⽤于疾病诊断的原理，并说明其优缺点。
5、最近甲型流感流⾏，请设计甲型流感的分⼦诊断⽅法，说明其原理。
第⼆、三章数据库⼀、单选题1、以下数据库不能⽤于检索核酸序列的是（ B ）A. GenBankB. PDBC. EMBLD.DDBJ2、蛋⽩质结构数据常保存为下⾯哪⼀种格式为后缀的⽂件（）A. PDBB. txtC. SeqD. mdb3、下列格式属于FASTA格式的是（）A. >seq1B.C. ATGCCATAD. > ATGCCATAATGCCATA ATGCCATA⼆、填空题1、阅读以下数据格式，写出以下标注的含义：LOCUS是，DEFINITION是，ACCESSION是，VERSION是，SOURCE是在论⽂中使⽤了NCBI数据库中的该序列，应标注该序列的编号，应填。
人促血小板生成素(TPO)原核表达载体pQE30-TPO的构建梁婷;侯桂华;李璐娜【期刊名称】《山东大学学报：医学版》【年(卷),期】2003(41)1【摘要】目的:获得人血小板生成素全长cDNA克隆,并构建重组表达载体pQE30-TPO。
方法:利用RT-PCR技术从人胎肝细胞mRNA中扩增目的基因,将扩增产物克隆至pMD18-T载体,经菌落PCR鉴定后,DNA序列分析重组质粒pMD18-T-TPO。
构建并鉴定原核表达载体pQE30-TPO。
结果:构建了重组克隆载体pMD18-T-TPO和重组表达载体pQE30-TPO,序列分析表明,获得的TPOcDNA序列与国内外报道的人促血小板生成素核苷酸序列完全一致。
结论:成功构建了重组表达载体pQE30-TPO,为TPO的进一步研究奠定了基础。
【总页数】3页(P67-69)【关键词】促血小板生成素;克隆;分子;序列分析;原核表达;人类【作者】梁婷;侯桂华;李璐娜【作者单位】山东大学医学院实验核医学研究所【正文语种】中文【中图分类】R558.3【相关文献】1.人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达 [J], 刘茵;颜景斌;王强;方彧聃;潘树标;黄英2.人血管生成素2原核表达载体的构建及鉴定 [J], 张中林;张吉发;艾勇彪;袁玉蜂;何跃明;刘志苏3.人血管生成素-1基因的克隆及原核、真核表达载体的构建 [J], 王钧;吴开春;张德新;幺立萍;樊代明4.促血小板生成素(TPO)的分子生物学特性及其临床应用前景 [J], 杨洁5.人血管生成素-1原核表达载体的构建与表达 [J], 吕永强;廖振林;童贻刚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用pQE30系统表达和纯化乙型肝炎病毒核心抗原周福元;隋礼丽;骆抗先;潘文胜;王海涛【期刊名称】《中国生物制品学杂志》【年(卷),期】2000(13)1【摘要】目的建立高效、快速、简便的表达和纯化ＨＢｃＡｇ系统，为进一步研究ＨＢｃＡｇ在乙型肝炎发病机理中的作用及ＨＢＶＣ基因变异产生ＨＢｃＡｇ特征。
方法应用ｐＱＥ３０系统在原核细胞表达和纯化ＨＢｃＡｇ。
结果目的蛋白表达量占细菌总蛋白的２６．２％；５００ｍｌ诱导表达的菌液可得平均５ｍｇ的ＨＢｃＡｇ；纯化的ＨＢｃＡｇ纯度可达到９１.０％；免疫印迹分析，表达的ＨＢｃＡｇ具有多克隆抗－ＨＢｃ结合活性。
结论建立了一套高效、快速表达和纯化ＨＢｃＡｇ系统。
【总页数】3页(P13-15)【关键词】pQE30;核心抗原;乙型肝炎病毒;系统表达【作者】周福元;隋礼丽;骆抗先;潘文胜;王海涛【作者单位】南方医院感染内科;北京市军事医学科学院五所十一室【正文语种】中文【中图分类】R373.21;R512.62【相关文献】1.HIV核心抗原p24原核系统的高效表达、纯化及活性鉴定 [J], 侯俊;貌盼勇;洪世雯;胡燕;杨健洋;沈宏辉;朱雷2.乙型肝炎肝组织中乙型肝炎表面抗原、核心抗原的表达与血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量及肝脏炎症的相关性研究 [J], 刘建芳;马玉魂;王铁武;李又平;胡怡3.传染性法氏囊病病毒抗原表位与乙型肝炎病毒核心抗原嵌合基因的构建及其表达产物分析 [J], 刘小娟;王永山;欧阳伟;张海彬;王忠灿;唐雨德4.乙型肝炎病毒前S2抗原决定簇（HBVPreS2epitope）与乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）的基因融合与表达 [J], 朱运峰;石成华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
