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完整版荧光漂白恢复技术

荧光漂白恢复技术
（fluorescence recovery after photobleaching ，FRAP）
09生物季刚裴家平
FRAP关键技术简介
?FRAP是用来测定活细胞的动力学参数。 ?FRAP是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁
移特性的技术。 ?当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530 –600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1 –2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were

荧光增白剂PPT课件

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优点，按优化反应条件：邻氨基对甲基苯酚与苹果酸物质的量比为2:1～2:1.05；除初始升温阶段外，反应温度分三段控制：第一阶段140℃左右，第二阶段170℃以下，第三阶段190℃以上，所合成的产品白度高而收率达85％以上。
8
实际工艺操作
将1050Kg氯苯投入缩合反应釜中，加入105Kg 对甲邻氨基苯酚、70Kg苹果酸，通入CO2气体，驱尽釜内空气，搅拌，升温回流反应，当冷凝器的分水器出水量达15Kg时，向反应釜中加入4～5Kg硼酸，继续加热回流反应，直至再分出水量达23Kg（共分
很好，但升华牢度不够好。 5
1.3 荧光增白剂DT合成工艺
荧光增白剂DT制备路线有十余种。国内基本上采用由邻氨基对甲苯酚与DL-苹果酸（羟基丁二酸）脱水缩合以“一锅煮”法反应而得到。即采用兰登贝格苯并噁唑合成法。近年来国内的合成研究也主要集中于此法改进。反应式如下：
O H
+ N H 2
C at H O O CC HC H 2 C O O H
荧光增白剂DT
1.1 发展 1.2 性质 1.3 合成工艺 1.4 应用 1.5 结论
1
1.1 荧光增白剂DT 发展
织物经漂白后，为了进一步获得满意的白度；或某些浅色织物要增加鲜艳度，通常采用能发荧光的有机化合物进行加工，这种化合物称为荧光增白剂。目前，荧光增白剂在纺织、造纸、塑料、及合成洗涤剂等工业都
2
有着广泛的应用。全世界生产的荧光增白剂现已有15种以上的结构，其商品已经超过1000多种，年总产量达10万吨以上，占染料总产量的12%左右，而且其产量年增长率大于染料或颜料的年增长率。
3
DT是瑞士汽巴公司五十年代末的产品, 商品名为Uvitex ERN,主要用于涤纶增白,也可用于塑料、涂料的增白。我国生产的荧光增白剂DT的产量约占增白剂总产量的1/4左右，是仅次于荧光增白剂VBL的重要品种。

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP共41页文档

Cartoon of FRAP
Bleach creates “hole” of fluorophores, Diffusion is measured by “hole filling in”
Bleach high power Monitor low power
Analysis of membrane
A way of understanding diffusion: Random Walk
Spread of molecules from one spot is proportional to square root of time for random walk. Therefore, to go 2X as far takes 4X as long.
e.g. Luby-Phelps et al., 1994. SekSek et al. 2019.
D = kT/f
D =w2/4D
Not reliable, cytoplasm complicated collection of fluid, cytoskeletal components, endosome, etc: simple viscosity not sufficient
Different bleaching geometries yield different types of information
Pre-bleach Photobleach image
Post-bleach image
No recovery Recovery
FRAP of GFP in Mitochondria
• Simplifies fits of recovery curves to:

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP

Fast limit: cytoplasm Slow limit: membrane bound
Suggests barriers (cristae) need to be large
Occlude 90% space
Verkman, TIBS, 2019
Size dependence of dextrans (polysaccharides) diffusion in solution
2000 Nature Cell Biology)
Experimental Setup
• Laser beam focused or through small field diaphragm
• Rapid shutter to switch from high powered beam for bleach to attenuated beam for recovery same power won’t work-Keep bleaching)
• Now can be done with laser scanning confocal instruments. (for some cases-e.g. membranes)
Idealized photobleaching data
Y = mobile fraction X
D =w2/4D
Diffusion of membrane components can be seen as a two dimensional diffusion problem
• Membrane is modeled as infinite plane
• Viscosity of the lipid bilayer is ~ 2 orders of magnitude higher than water

染整工艺原理上课件第三章漂白

2、在双氧水漂白液中为何要加入稳定剂？
3、水玻璃做为氧漂稳定剂的主要缺点是什么？
4、试设计合理的双氧水连续汽蒸漂白工艺（包括工艺处方、工艺流程、工艺条件）
铜离子和水玻璃对H2O2 漂白影响（催化、稳定）
水玻璃 g/L
7.0
Cu2SO4 g/L 2h后分解率,% 58
100(45min)
织物白度，% 95.5
（二）常用漂白剂
1.还原剂漂白保险粉（Na2S2O4)、硫酸氢钠（ NaHSO3 ）、 SO2 • 漂白效果不稳定，日照泛黄 • 羊毛 2．氧化剂漂白 • 氯漂（ NaOCl）、亚漂（NaClO2 ）、氧漂（ H2O2） • 白度高，白度稳定性好 • 会损伤纤维 • 适用各种纤维
氯氯(Cl2)、次氯酸钠（NaClO）系亚氯酸钠（NaClO2)
名词
有效氯：指次氯酸钠溶液加酸后释放出氯气的数量。P110
碱煮强力：1g/L烧碱溶液中沸煮1h后的强力
三种常用漂白剂的使用性能比较
NaOCl
H2O2
NaClO2
适用对象 C.及混纺中 C.及混纺中高较高档棉
低档品档, 蛋白质织物及其混纺物
白度
一般
较好
很好
白度稳定性脱氯不净不易泛黄
脱氯不净
稳定剂类型及作用原理
按作用机理分： • 吸附型 • 络合型按化学组成分： • 硅类稳定剂 • 非硅类稳定剂
吸附型稳定剂
• 硅酸钠（Na2SiO3) 硅酸钠在硬水中（适量钙、镁盐存在）形成硅
酸盐胶体MgSiO3(CaSiO3)，能吸附重金属离子。采用软水则加入0.1～02g/L硫酸镁.
优点：稳定效果好，价格便宜，白度好缺点：易结硅垢，手感发硬，染疵，沉淀在设备导布

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP 荧光漂白后恢复(FRAP-40页精品文档

Cartoon of FRAP
Bleach creates “hole” of fluorophores, Diffusion is measured by “hole filling in”
Bleach high power Monitor low power
Analysis of membrane
NNNooA way of understanding diffusion: Fick’s Law J D x
age • Jisflux • D is diffusion constant • is concentration
Diffusion Constant: What controls it?
J D
x
Verkman, J. Cell Biology 1999
Heavy dextrans very slow Mobile fraction low: binding More polarizable
FRAP in Cytoplasm
J D
x
• Problem is much more complicated because of three dimensional freely diffusing geometry.
• As shown by Saffman and Delbruck, the translational diffusion coefficient for membrane components depends only on the size of the membrane spanning domain
Axelrod et al., 1976
PSF and Beam Waist

荧光漂白恢复技术PPT

（PLoS ONE |August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e22962）
Methods 1.Cell culture
Norden laboratory feline kidney (NLFK) and HeLa cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)at 37℃ in the presence of 5% CO2.
（1）注意实验温度的控制。（2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而定。（3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂白后的荧光淬灭。
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FRAP技术的不足之处
第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能观察单个蛋白的移动。其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部条件的限制。
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530–600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1–2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were measured by bleaching fixed cells (Fig. 1). ImageJ [32] was then used to construct an average shape and intensity profile of that region.

教学课件：第十三章-荧光增白剂

在个人护理用品中，荧光增白剂主要用于沐浴露、洗发水、润肤乳等产品的配方中，增加产品的视觉效果和使用感受。
在化妆品中，荧光增白剂主要用于粉底、口红、眼影等产品的制造中，使产品更加亮丽和具有吸引力。
其他领域
荧光增白剂还广泛应用于纸张、涂料、油漆、油墨等领域中，以提高产品的白度和亮度，改善视
觉效果和品质。
耐热性
稳定性
荧光增白剂在高温下保持其性能的能力，通常以热稳定性表示。
荧光增白剂在不同环境条件下保持其性能的能力，包括化学稳定性、pH稳定性等。
03
荧光增白剂的应用领域
纺织品领域
荧光增白剂在纺织品领域中主要用于棉、麻、丝、毛等天然纤维以及涤纶、腈纶等合成纤维的染色和加工过程中，提高产品的白度和光泽度，增强视觉效果。
THANKS
感谢观看
纺织工业
用于棉、麻、丝、毛等纤维的增白和调色，提高纺织品的白度和鲜艳度。
日化产品
用于洗涤剂、洗衣粉、肥皂等日化产品的增白和调色，提高
产品的白度和亮度。
荧光增白剂的发展历程
20世纪初
荧光增白剂的发现和研究阶段，最早的荧光增白剂是苯酚磺酰酞。
20世纪50年代
荧光增白剂开始进入工业化生产和应用阶段，主要用于纸张和纺织品的增白。
教学课件：第十三章-荧光增白剂
• 荧光增白剂简介 • 荧光增白剂的种类与性能 • 荧光增白剂的应用领域 • 荧光增白剂的生产工艺与技术 • 荧光增白剂的安全与环保问题 • 教学总结与展望
01
荧光增白剂简介
定义与特性
定义
荧光增白剂是一种能够吸收紫外光并发出蓝紫色荧光的染料，主要用于提高塑料、纸张、纤维等材料的白度和亮度。

看荧光增白剂如何逆转织物暗淡无光

看荧光增白剂如何逆转织物暗淡无光
对于白色的纺织品，通常会有一点点蓝光被吸收，使得产品看起来变成了黄色，同时白度下降显出暗旧感。

在发明荧光增白剂前，抵消黄色的其中一种方法是使用蓝色染料。

然而添加蓝色会减少可见光光谱中的长波长部分的反射。

其结果是，纺织品能够呈现出中和的白色，但同时也损失了一部分亮度，使材料看起来变得灰暗。

另一种方法是使用化学漂白，通过氧化纺织品表面的色素使其褪色，但同时对材料本身有着相当的破坏作用。

幸运的是，在20世纪初，荧光增白剂被发现后，以上两种方法的缺陷都被克服了。

荧光增白剂本省是无色，即使相对于淡色的有机色素来说。

它的原理是能吸收紫外线光并重新发出蓝色光。

与添加蓝色染料相比，荧光增白剂主要减少紫外线和近似可见光的反射；而在可见光部分，光强度由于荧光反射还大大增强了，因此荧光增白剂可用来增强光源。

在阳光下，荧光增白剂可以抵消纺织品上不需要的黄色。

更美妙的是，由于人眼不可
见的紫外线被转换成了可见光，材料的亮度而被提高成为一种绚丽的白色。

杭州绿典化工有限公司感到非常激动的是，荧光增白剂成功逆转暗淡无光的纤维织物，给到他们亮白的视觉效果，得到全新的体验！。

齐全版(荧光PCR技术)ppt课件

实时荧光定量PCR技术
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。

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荧光漂白恢复测定巨噬细胞Fc受体的荧光恢复率和运动分数
（山东大学硕士学位论文《荧光漂白恢复测定巨噬细胞Fc受体的流动性》，李建业，005.5）
▪ 采用Alexa 488标记的羊抗鼠IgG间接标记巨噬细胞Fc受体，用激光共聚焦系统的强脉冲激光漂白，弱强度激光扫描，光电倍增管(PMT)检测， Fluoview软件记录数据并分析处理。
Page ▪ 11
漂白区域的荧光强度随时间的变化示于图2.11。
Page ▪ 12
漂白以后恢复过程荧光强度的变化示于图2.13。
Page ▪ 13
Page ▪ 14
漂白区域在漂白前后的荧光强度随时间的变化示于图2.14。
说明：细胞膜具有流动性，膜表面上Fc受体能够迁移。
Protein Diffusion in Mammalian Cell Cytoplasm
定。 ▪ （3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂
白后的荧光淬灭。
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FRAP技术的不足之处
▪第一,它只能检测膜蛋白的群体移动,而不能观察单个蛋白的移动。
▪其次,它不能证明膜蛋白在移动时是否受局部条件的限制。
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FRAP 的应用
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分子的定性知识，基本了解了各细胞器的分子组成，找到许多在细胞生命周期中发挥重要作用的蛋白质，确认了许多重要蛋白质之间相互作用的存在并初步描绘出一些信号通路。 ▪ 但细胞的各种生物学功能和现象都是借助相关分子实现的，当前的研究重点和难点就集中于解答分子实现各种功能的机制。 ▪ 这就需要掌握活细胞生理状态下分子运动的各种信息，近年来发展的一些技术手段为获得有关重要信息提供了有力的工具，FRAP技术就是其中一种重要方法。
Page ▪ 3
FRAP技术的基本要求
▪ 选择合适的荧光探针 ▪ 具备精确可控的激光激发和荧光检测设备
激光扫描共聚焦显微镜
Page ▪ 4
FRAP 的三个阶段
漂白前
漂白
漂白后恢复
用尽可能弱的激光扫描全细胞
使用强激光在短时间内扫描漂白区域
用尽可能弱的激光扫描全细胞
Page ▪ 5
注：
➢漂白前和漂白后恢复都用尽可能弱的激光扫描全细胞，目的是得到扫描图像而不引起荧光淬灭，
Page ▪ 2
FRAP原理
▪ In FRAP, a region of the cell is exposed to high-intensity laser light, causing the fluorophores within that region to irreversibly lose their ability to fluoresce. Recovery of fluorescence in that region yields information about molecular diffusion and binding in the cell.
➢漂白阶段则使用强激光在短时间内扫描漂白区域，目的是使区域内的荧光全部淬灭。
➢在整个过程中，监测漂白区域在各时间段的荧光强度变化并绘制曲线，从恢复曲线及其数据就可以得到关于分子迁移速率、动态分子比例等信息。
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Page ▪ 7
FRAP实验注意事项
▪ 做FRAP实验还应当注意以下几点，否则就易得到错误结果。 ▪ （1）注意实验温度的控制。 ▪ （2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而
（PLoS ONE |August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e22962）
Methods 1.Cell culture
Norden laboratory feline kidney (NLFK) and HeLa cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Paisley, UK)at
荧光漂白恢复技术
（fluorescence recovery after photobleaching ，FRAP）
09生物季刚裴家平
FRAP关键技术简介
▪ FRAP是用来测定活细胞的动力学参数。 ▪ FRAP是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁
移特性的技术。 ▪ 当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内
37℃ in the presence of 5% CO2.
2. FRAP experiments
The FRAP experiments were performed on a laser scanning confocal microscope FV1000 with an IX-81 microscope frame(Olympus, Tokyo, Japan) using an Olympus UPLSAPO 606 (NA= 1.2) water immersion objective. The sample stage was heated to 37uC prior the experiments. To image the cell geometry, a confocal stack was acquired before and after the FRAP experiment. The voxel size was adjusted to (200 nm)3or(150 nm)3 .The pinhole size was adjusted to 1 Airy unit. The 514 nm laser line was used for EYFP excitation and the emitted fluorescence was detected using a 530–600 nm band pass filter.Imaging was performed with a laser intensity of 0.1–2 For bleaching a circular (r = 1.85 mm and 2.83 mm) region of interest(ROI) was defined in the middle of the cytoplasm. As bleaching times in FRAP are usually rather large compared to the time scales of the measured diffusion processes, the region of the cell, which is actually bleached, is usually larger than the defined ROI. The size of the actually bleached region and its intensity distribution were measured by bleaching fixed cells (Fig. 1). ImageJ [32] was then used to construct an average shape and intensity profile of that region.

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