嗜酸乳杆菌的测定方法

嗜酸乳杆菌抑菌能力的试验【关键词】嗜酸乳杆菌；牛津杯法；抑菌圈；发酵液文章编号：issn1006—656x（2013）09 -0100-01【前言】嗜酸乳杆菌是人体肠道内的重要益生菌，能调节肠道微生态平衡，抑制病原微生物生长，缓解乳糖不耐症，降低胆固醇和抑制肠道腹泻等作用，被视为第三代酸乳发酵剂菌种[1]。

研究嗜酸乳杆菌对不同病原菌的抑菌效果、探讨其抑菌因素，对嗜酸乳杆菌产品的应用具有一定的意义。

一、材料与仪器（一）材料：（1）实验菌株：嗜酸乳杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、八叠球菌、枯草芽孢杆菌（实验室保存的菌株）（2）培养基：pca培养基、lb培养基、mrs培养基13%牛奶培养基（用脱脂乳粉配制成13%水溶液，115℃10min灭菌）（3）设备名称、型号、厂家yxq-ls-50sl型高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）pyx-dhs型隔水式点热恒温培养箱（上海市跃进医疗器械厂）jt-5003型精密电子天平（深圳市华恒仪器有限公司）微生物实验常规玻璃仪器（二）实验方法（1）嗜酸乳杆菌发酵菌悬液、发酵液抑菌效果试验将加有溴钾酚紫指示剂的pca培养基分装于试管中，每管约15ml，可确保每个平板的营养成分基本相同，添加指示剂有利于观察抑菌圈，然后于121℃灭菌20min。

分别吸取1ml指示菌的10-1稀释液于冷却至45-50℃培养基中，这一稀释度生长的菌落能够均匀的布满整个平板，确保实验的准确度，混匀后倒入9cm的灭菌平板中。

培养基凝固后，在无菌条件下将3个灭菌的牛津杯均匀地放置在平板上，轻轻按压，使其与平板培养基接触面无空隙。

在3个杯中分别加入0.1ml的嗜酸乳杆菌菌悬液、嗜酸乳杆菌培养上清液、mrs 液体培养基，37℃培养24h，测定抑菌圈直径。

每个样品做两个重复，结果取平均值。

（2）牛奶发酵物抑菌效果试验13%牛奶培养基，115℃10min灭菌，冷却40℃左右，按5%的接种量接入嗜酸乳杆菌菌种，42℃恒温培养约4h至牛奶凝固，即牛奶发酵物。

酸乳杆菌的生物学论文1方法1.1生长曲线的测定嗜酸乳杆菌AP117经活化后,以5%的接种量接种到MRS液体培养基中,30益静置培养24h,每隔2h取样,稀释涂布MRS固体培养基平板,培养20~24h后数活菌数,每毫升的细菌菌落数以对数值表示。

1.2耐酸能力的测定将嗜酸乳杆菌AP117经MRS液体培养基活化后,按5%接种量接种于MRS液体培养基,30益培养16h备用。

用0.1mol/L的HCl分别调节MRS液体培养基pH为1.5、2.0、3.0、4.0和4.5。

取16hAP117培养液,按5%接种量接种于不同pH的液体培养基中,30益培养2h,采用倾注平板法,以MRS固体培养基作为计数培养基,测定培养液的活菌数,平行测定3次,取平均值,以刚接种时的活菌数为对照,计算菌株在不同酸性条件下处理2h后的存活率。

1.3耐胆盐能力的测定将嗜酸乳杆菌AP117经MRS液体培养基活化后,按5%接种量接种于MRS液体培养基,30益培养16h备用。

用猪胆盐分别调节MRS液体培养基,使胆盐含量分别为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%。

取16h培养液按5%接种量接种于不同胆盐含量的液体培养基中,30益培养2h,采用倾注平板法,以MRS固体培养基作为计数培养基,测定培养液的活菌数,平行测定3次,取平均值,以刚接种时的活菌数为对照,计算在不同胆盐条件下处理2h后的菌株存活率。

2结果与讨论2.1嗜酸乳杆菌AP117的生长动态曲线嗜酸乳杆菌AP117在温度30益,静置培养24h,其活菌数的对数值随时间变化关系如图1。

由图1看出培养6h后活菌浓度达到105cfu/mL,之后进入对数生长期,14~20h 为稳定期,活菌浓度超过1010cfu/mL。

2.2嗜酸乳杆菌AP117的耐酸性乳酸菌可以利用的耐酸性机制有许多种,目前没有统一定论,大体上可以分成8类:质子泵、蛋白质修复、DNA修复、调节因子、细胞密度的改变、细胞膜的改变、产生碱和代谢方式的改变,其耐酸性机制因菌株不同而有差异。

嗜酸乳杆菌的检测1、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

1.1恒温厌氧培养箱：37℃士1℃。

1.2冰箱：2℃～5℃。

1.3天平：感量为0.1g。

1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。

1.5振荡器。

1.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

1.7无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

1.8无菌培养皿：直径90mm。

1.9显微镜：10倍～100倍。

1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2、培养基和试剂2.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基2.1.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏10.0g 酵母浸膏5.0g 葡萄糖20.0g吐温-80 1.0g 柠檬酸铵2.0g 乙酸钠5.0g 硫酸镁0.1g硫酸锰0.05g 磷酸氢二钾2.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000mL2.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH 至7.3±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。

2.2 MRS肉汤培养基2.2.1 MRS肉汤培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏10.0g 酵母浸膏5.0g 葡萄糖20.0g吐温-80 1.0g 柠檬酸铵2.0g 乙酸钠5.0g 硫酸镁0.1g硫酸锰0.05g 磷酸氢二钾2.0g 蒸馏水1000mL2.2.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH 至7.3±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。

2.3无菌生理盐水2.3.1成分氯化钠8.5g 蒸馏水1000mL2.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。

2.4 革兰氏染色2.4.1结晶紫染色液2.4.1.1 成分结晶紫1g 95%乙醇20 mL 1%草酸铵水溶液80 mL2.4.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

混合型饲料添加剂嗜酸乳杆菌的检验操作规程
Lactobacillus acidophilus
1、质量标准来源：GB/T 20191-2006
2、名称：嗜酸乳杆菌
3、检验过程
3.1、感官：取本品适量，置于非太阳光直射条件下的明亮处，目视检测，本品色泽一致，无发霉变质、结块及异味、异臭。

3.2、粒度：精密称取本品100g，置于0.400/0.25mm金属丝编制筛中，手动或机械振摇10分钟，本品应100％通过0.400/0.25mm 金属丝编制筛。

3.3、水分：取本品1g，精密称定，置于经105℃烘干至恒重的扁形称量瓶中，在105℃条件下干燥至恒重，减失重量应不得过
4.0%。

3.4、嗜酸乳杆菌的测定：
3.4.1 试剂和培养基
3.4.1.1 稀释液：0.85%生理盐水经121℃高压灭菌20分钟；3.4.1.2 改良MC培养基：经121℃高压灭菌20分钟，在无菌条件下注入灭菌后的平皿中，每个平皿约注入15ml培养基。

3.4.2 操作步骤
3.4.2.1 以无菌操作将经过充分要匀的试料25g（或25mL）放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内配成1:10的均匀稀释液。

嗜酸乳杆菌检测方法国标嗜酸乳杆菌是一种重要的益生菌，具有多种功效，如增强免疫力、调节肠道菌群平衡、预防便秘等。

因此，对于嗜酸乳杆菌的检测方法，国家制定了相应的标准，以下是关于嗜酸乳杆菌检测方法国标的中文介绍。

一、标准简介《食品安全国家标准嗜酸乳杆菌检验方法》（GB/T 4789.44-2016）是从食品安全角度出发，规定了嗜酸乳杆菌的检测方法。

该标准适用于所有含嗜酸乳杆菌的食品、饮料和饲料的检测。

二、检测方法概述1.样品准备样品应根据其特点进行适当的预处理。

针对不同的样品类型，标准中提供了详细的处理方法。

2.培养基选择培养基应选择适合嗜酸乳杆菌生长的培养基，标准中推荐的培养基为MRS培养基。

3.细菌计数将样品加入到适量的培养基中，进行混合均匀，然后进行种菌。

瓶子应密封好，置于摇床上进行培养。

在一定时间后，对嗜酸乳杆菌的数量进行计数。

三、实验步骤1.样品准备：样品应根据其特点进行适当的预处理。

比如在含有蛋白质的样品中加入胆盐酚，并在低温下放置。

在含有脂质的样品中加入高乳酸杆菌培养基。

2.制备培养基：按照标准的配方制备培养基。

本标准推荐的培养基为MRS培养基。

将制备好的培养基加热灭菌。

3.菌种制备：将嗜酸乳杆菌菌种接种到培养皿中，进行预培养。

4.菌液调整：将培养基加热到50℃，用过滤器过滤，得到无菌的培养基。

待培养基冷却至30℃左右，加入25℃的菌液（OD值为0.2~0.3），混合均匀。

5.接种：将1 ml的培养液加入到15 ml的培养基中，混合均匀。

将调制好的培养基按照设计格式分装到培养皿中。

6.培养：将培养皿进行密封，放入培养箱中，在30℃下培养48小时。

7.计数：对嗜酸乳杆菌进行计数，根据样本的不同类型，采用不同的计数方法。

四、结果判定根据国家标准规定的计数方法，计算出嗜酸乳杆菌的数量。

对于非检出结果和检出结果，可以参照国家标准中所列举的判定标准。

五、结论嗜酸乳杆菌是一种重要的益生菌，有多种功效，因此其检测方法国家也有相应的标准。

乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法张娜娜1，刘 洋1,*，俞 漪1，赵 渝2，窦同海3，徐 琼1，段文锋4，翁史昱1（1.上海市质量监督检验技术研究院，国家食品质量监督检验中心（上海），上海 200233；2.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；3.复旦大学生命科学学院，上海 200438；4.上海市质量管理科学研究院（上海），上海 200050）摘 要：目的：为快速准确检测乳酸菌饮料中的嗜酸乳杆菌，建立实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法。

方法：根据嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR保守区域设计特异性引物与探针，借助建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性、灵敏度、重复性以及抗干扰能力验证，并利用模拟样品对方法进行检验，最后对市售的实际样品进行检测。

结果：该方法的特异性较好；方法的绝对灵敏度达到3 pg，相对灵敏度达103 CFU/mL；重复性检测表明相对标准偏差在2.6%以下。

同时进行杂菌干扰实验，在纯基因组水平和培养物水平混合大肠杆菌，扩增均无明显影响，表明建立的方法抗干扰能力较好。

利用建立的实时荧光定量PCR方法对模拟样品进行检测并建立标准曲线，得出R2为0.987，线性较好，可进行实际样品的检测。

对市售的11 份样品进行检测，其中6 份含有嗜酸乳杆菌菌株，5 份不含嗜酸乳杆菌菌株，标记嗜酸乳杆菌的样品全部检测出嗜酸乳杆菌且含量在5.83×102～3.68×104 CFU/mL之间。

结论：建立的实时荧光定量PCR方法可快速、准确地检测出乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌。

关键词：实时荧光定量PCR；嗜酸乳杆菌；定量；检测Real-Time Fluorescent Quantitative PCR Method for Detection of Lactobacillus acidophilus in Probiotic Beverages ZHANG Nana1, LIU Yang1,*, YU Yi1, ZHAO Yu2, DOU Tonghai3, XU Qiong1, DUAN Wenfeng4, WENG Shiyu1(1. Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research,National Center of Supervision and Inspection on Food Products Quality (Shanghai), Shanghai 200233, China;2. College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China;3. College of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China;4. Shanghai Academy of Quality Management (Shanghai), Shanghai 200050, China)Abstract: Objective: To establish a real-time fluorescent quantitative PCR assay for the rapid and accurate detection of Lactobacillus acidophilus in probiotic beverages. Methods: Specific primers and probes were designed based on the conserved SPIDR region of L. acidophilus NCFM. The established method was assessed with respect to specificity, sensitivity and reproducibility, and it was applied to model and commercial samples. Results: The method had good specificity. The absolute sensitivity was 3 pg and the relative sensitivity was 103 CFU/mL. The repeatability expressed as relative standard deviation (RSD) was below 2.6%. At the same time, the amplification was not affected by the coexistence of pure genome or culture of Escherichia coli, indicating that the method has good anti-interference ability. This method showed good linearity (R2 = 0.987) and it was feasible to detect actual samples. Of 11 commercial samples, 6 contained L. acidophilus strains while the rest did not. L. acidophilus was detected in all samples labeled with L. acidophilus in the range of 5.83 × 102 to 3.68 × 104 CFU/mL. Conclusion: The real-time fluorescence quantitative PCR method can quickly and accurately detect L. acidophilus in probiotic beverages.收稿日期：2018-01-23基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31301486）；上海市自然科学基金项目（13ZR1439600）；国家质量监督检验检疫总局科研项目（2017QK167）第一作者简介：张娜娜（1992—）（ORCID: 0000-0003-0811-2018），女，硕士研究生，主要从事食品微生物及应用研究。

食品中嗜酸乳杆菌的筛选与应用研究食品中的菌群是决定其质量和安全性的重要因素之一。

其中，嗜酸乳杆菌是一类常见的菌种，被广泛应用于食品工业中。

本文将讨论嗜酸乳杆菌的筛选方法以及其在食品中的应用研究。

一、嗜酸乳杆菌的筛选方法嗜酸乳杆菌是一类产乳酸的革兰氏阳性杆菌，可以广泛存在于食品中，如酸奶、乳酸发酵面包等。

筛选优良的嗜酸乳杆菌菌株是保证食品发酵过程和保质期稳定性的关键。

目前，常用的嗜酸乳杆菌筛选方法主要包括传统方法和分子生物学方法两种。

传统方法是指基于菌株的形态学和生理学特征进行筛选。

例如，通过菌落形态、生长速度、产酸能力和产乳酸量等指标进行评估。

此外，还可以使用一些特殊培养基，如MRS培养基（Man-Rogosa-Sharpe培养基），来选择适应性强、生长繁殖能力优越的嗜酸乳杆菌。

分子生物学方法是近年来新兴的筛选方法。

利用PCR技术对样品中的DNA进行扩增，然后通过测序鉴定嗜酸乳杆菌的特定基因序列。

这种方法不仅能够快速准确地筛选出嗜酸乳杆菌，还能明确其亲缘关系和遗传多样性。

二、嗜酸乳杆菌在食品中的应用研究1. 酸奶中的应用嗜酸乳杆菌是制作酸奶的主要菌种之一。

它能够破坏乳中的葡萄糖分子，产生乳酸和其他有益物质，从而降低酸奶的pH值，增加其酸度和稳定性。

此外，嗜酸乳杆菌还能增强酸奶的口感和风味，提高其养分吸收率，对人体健康有益。

2. 乳酸发酵面包的制作嗜酸乳杆菌在乳酸发酵面包的制作中也有重要应用。

在面酵过程中，嗜酸乳杆菌能够分解面粉中的糖类，产生乳酸和其他发酵产物。

这些物质能够给面包赋予独特的香味和口感，并且能够延长面包的保质期。

此外，嗜酸乳杆菌还能通过酸化作用，抑制有害菌的生长，提高面包的卫生安全性。

3. 其他食品中的应用嗜酸乳杆菌不仅可以应用于酸奶和乳酸发酵面包，还可以用于其他食品的发酵和保鲜。

例如，嗜酸乳杆菌可以发酵果汁、蔬菜和肉制品，增加其口感和风味。

此外，嗜酸乳杆菌还被应用于干酪和酸奶风味饮料等产品的生产过程中，以提高其品质和营养价值。

食品中嗜酸乳杆菌的检测与保健功能研究随着人们对食品安全和健康意识的不断提升，食品中嗜酸乳杆菌逐渐受到了广泛关注。

嗜酸乳杆菌是一类广泛存在于自然界中的益生菌，通过其具有的保健功能，可以对人体产生一系列正面的影响。

然而，由于嗜酸乳杆菌的数量在食品中较少且容易受到环境的影响，因此对其进行检测并保持其活性成为了一项具有挑战性的工作。

食品中嗜酸乳杆菌的检测方法主要有传统培养法、分子生物学方法和生物传感器等。

传统培养法是一种比较常用的方法，可通过将食品样品在特定培养基上进行培养，然后观察菌落形态进行检测。

但是，这种方法需要较长时间，且存在一定的操作难度。

分子生物学方法则是近年来较为流行的检测手段，可以通过PCR技术、实时荧光PCR等方法对食品样品中的嗜酸乳杆菌进行快速准确的鉴定。

生物传感器则是一种新兴的检测技术，通过将特定的生物元件与传感器相结合，实现对嗜酸乳杆菌的高灵敏度检测。

这些方法各有优劣，选择适合的方法取决于实际需求。

嗜酸乳杆菌具有一系列的保健功能，其通过抑制有害菌的生长、增强免疫力、改善肠道菌群平衡等途径对人体健康产生积极影响。

首先，嗜酸乳杆菌可以产生有益物质，如乳酸等，通过降低周围环境的pH值，抑制有害菌生长。

其次，嗜酸乳杆菌可以促进肠道菌群平衡，抑制有害菌的繁殖，维护肠道健康。

此外，嗜酸乳杆菌还可以增强人体的免疫力，提高抵抗力，减少感染风险。

这些功能让嗜酸乳杆菌成为了一种理想的食品添加剂。

尽管嗜酸乳杆菌在食品中的检测和保健功能研究已经取得了一些进展，但仍然存在一些挑战和难题需要解决。

首先，食品中嗜酸乳杆菌数量相对较少，检测的灵敏度要求较高，因此需要进一步提高检测方法的准确性和灵敏度。

其次，嗜酸乳杆菌在食品加工和贮存过程中容易失活，因此如何保持其活性也成为了一个关键问题。

此外，嗜酸乳杆菌与其他益生菌的共存关系以及与食品中的其他微生物的相互作用等问题也需要进一步研究。

综上所述，食品中嗜酸乳杆菌的检测与保健功能研究具有重要的现实意义和科学价值。

乳酸菌饮料中嗜酸乳杆菌的实时荧光定量PCR检测方法嗜酸乳杆菌是重要的益生菌，被大量应用在食品中。

讨论表明嗜酸乳杆菌能在乳制品中产生乳酸，并能通过氨基酸代谢增加风味。

嗜酸乳杆菌主要作用有降低pH值、产生抗菌素（如嗜酸菌素和乳酸杀菌素等），在肯定程度上抑制肠道中有害微生物的有害作用。

有讨论发觉嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、腹泻致病菌等均有抑制作用；大量的嗜酸乳杆菌还可阻碍胆固醇的合成，降低血浆中胆固醇含量；另外对于乳糖不耐症也有肯定的疗效。

嗜酸乳杆菌对肠道菌群的平衡和对微生态的调整也证明其对健康具有促进的作用。

1.实时荧光定量PCR方法的特异性全部嗜酸乳杆菌的标准菌株均有明显扩增，且Ct值在16～18之间，其他菌株均无明显的扩增；采纳乳杆菌通用引物对全部菌株进行扩增时，可见到清楚的扩增条目。

证明本讨论建立的实时荧光定量PCR检测方法对于嗜酸乳杆菌有较好的特异性。

2.检测方法的灵敏度①实时荧光定量PCR方法的肯定灵敏度嗜酸乳杆菌ATCC4356、CICC6082、NCFM、La-14可稳定检测的最低质量浓度为0.00058ng/L。

每个模板添加4L，即检测限在3pg左右，本讨论的实时荧光定量PCR体系的肯定灵敏度达到3pg。

②实时荧光定量PCR的相对灵敏度嗜酸乳杆菌ATCC4356的肯定灵敏度可稳定检出的最低浓度为103.实时荧光定量PCR方法的重复性检测结果嗜酸乳杆菌ATCC4356不同的核酸浓度扩增，每个质量浓度6个平行，最终试验结果Ct值的SD介于0.14～0.56之间，RSD介于0.862%～2.55%之间，均在可接受范围内。

证明建立的实时荧光定量PCR方法重复性较好。

4.实时荧光定量PCR方法的抗干扰力量在样品中混入105.模拟样品的检测及标准曲为验证建立的方法是否可以在实际样品中进行检测，在进行实样检测之前，利用模拟样品对该方法进行验证。

这样不仅可以节省时间，且节约成本在不含嗜酸乳杆菌的乳酸菌饮料为基质的模拟样品检测中，以Ct值为纵坐标，以嗜酸乳杆菌标准株已知的不同稀释菌数对数Lg（CFU/g）为横坐标建立标准曲线，得出线性方程为y=－3.312 4x＋38.939，R6.实际样品检测结果11份样品中，6份样品检测出含有嗜酸乳杆菌，编号分别为B1、B4、B6、B7、B8、B9，这与购买样品的便签信息全都。