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酶工程第6章酶的结构和功能

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食品化学 第六章_酶

食品化学 第六章_酶

第三节

固定化酶
固定化酶是通过吸附、偶联、交联和包埋等物理或 化学的方法把酶连接到某种载体上，做成仍具有酶 催化活性的水不溶性酶。

作用特点：稳定性提高，易分离，可反复使用，提 高操作的机械强度。


1.固定化酶的制备
2.固定化酶在食品工业中的应用

酶的化学本质是蛋白质，其最大弱点是不稳定性，对
体。

酶和一般催化剂的共性：
◦ 加快反应速度；
◦ 不改变平衡常数；
◦ 自身不参与反应。

专一性：即酶只能对特定的一种或一类底物起作用。 可分为：
◦ 绝对专一性：有些酶只作用于一种底物，催化 一个反应，而不作用于任何其它物质。 ◦ 相对专一性：这类酶对结构相近的一类底物都 有作用。包括键的专一性和基团的专一性。 ◦ 立体异构专一性：这类酶只对底物的某一种构 型起作用，而不催化其他异构体。包括旋光异 构专一性和几何异构专一性。
生成不稳定的中间络合物
（ES），再分解成产物（ P）并释放出酶，使反应
E1
能 量 水 平
ES
E2
E+S
G
沿一个低活化能的途径进
行，降低反应所需活化能 ，所以能加快反应速度。
P+ E
反应过程

酶原：没有活性的酶的前体。 酶原的激活：酶原在一定条件下经适当的物质作用
可转变成有活性的酶。酶原转变成酶的过程称为酶
原的激活。

本质：酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露
的过程。
第二节

影响酶活力的因素
一、底物浓度对酶活力的影响
在酶浓度，pH，温度等条件 不变的情况下研究底物浓度 和反应速度的关系。如右图 所示： 在低底物浓度时, 反应速度 与底物浓度成正比，表现为 一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，几 乎所有的酶都与底物结合后， 反应速度达到最大值 （Vmax），此时再增加底 物浓度，反应速度不再增加， 表现为零级反应。

《酶工程》课后知识题目解析

《酶工程》课后知识题目解析

《酶工程》课后知识题目解析第一章酶工程基础1.名词解释：酶工程、比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学①酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。

②比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。

③酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。

其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。

④酶活国际单位: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。

⑤酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。

2.说说酶的研究简史酶的研究简史如下：(1)不清楚的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。

(2)酶学的产生：1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验；1822年，美国外科医生Beaumont 研究食物在胃里的消化；19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。

1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德国科学家K?hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。

(3)酶学的迅速发展（理论研究）：1926年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。

3.说说酶工程的发展概况I.酶工程发展如下：①1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960年，法国科学家Jacob和Monod 提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。

酶工程第6章-脱氧核酶2012

酶工程第6章-脱氧核酶2012
1.转染12h的阴性对照； 2. 转染12h； 3.转染24h； 4.5.转染36h； 6. 转染36h的阴性对照； 7. 8 转染36h的局部放大
图； 9.转染48h； 10. 转染60h； 11. 转染60h后的阴性对
照； 12. 转染72h。
利用核酶或脱氧核酶抑制有害基因的基本原理
对医疗应用来说最主要的还是寻找那些具 有切割特定RNA顺序的核酶，从而可以在体 内抑制某些有害基因。
基因治疗的概念出现在二十几年前，现在已 经在临床上得到了实际应用。基因治疗最早的临 床研究是1990年Blaese 等进行的对腺苷脱氨酶 (ADA)缺乏症的治疗，随后在对遗传病、病毒侵染、 肿瘤等疾病的治疗中得到广泛的应用。中国也是 开展基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等开 展了血友病B基因治疗的临床实验，并取得比较理 想的效果。
结构稳定。生理条件下DNA比RNA稳定106 倍，DNA的磷酸二酯键比蛋白质的肽键抗 水解能力要高100倍。
成本低廉、易于合成和修饰。 脱氧核酶具有催化效率高和高度专一性等
特性。
脱氧核酶(Deoxyribozyme，DRz)的分类
分类依据：借鉴国际酶学委员会对蛋白酶 的分类方法，将DRz 分成4 类:水解酶、转移 酶、合成酶和氧化酶 具有水解酶活性的DRz 1、作用于RNA 的DRz 主要包括水解RNA的“10-23”、“8-17”DRz。
手枪形脱氧核酶自我剪切作用机理
切割点
10
5‘ 20
3‘ C A
茎I(结合部位)
40
茎II (催化部位) 30
手枪形结构脱氧核酶的自身切割位点在第14nt处，其3’端约27个碱基对自身切割活 性的发挥至关重要。
“二分”型结构脱氧核酶

酶工程课程复习资料整理

酶工程课程复习资料整理

绪论一．酶是生物催化剂酶是具有生物催化功能的生物大分子，按其化学组成的不同可以分为两类：蛋白类酶（P-酶）与核酸类酶（R-酶）。

理解：1、酶是由生物细胞产生2、酶发挥催化功能不仅在细胞内，在细胞外亦可二．酶学研究简史1897年，Buchner兄弟发现，用石英砂磨碎的酵母细胞或无细胞滤液能和酵母细胞一样进行酒精发酵。

标志着酶学研究的开始。

说明：酶分子不仅只是在细胞内起作用，而且在细胞外同样具有催化功能。

这一发现开启了现代酶学，乃至现代生物化学的大门。

三．酶工程的现状：目前大规模利用和生产的商品酶还很少。

第一章．酶学概论第一节．酶作为生物催化剂的显著特点一．酶作为生物催化剂的显著特点：高效、专一二．同工酶（概）：能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成不同的一组酶。

三．共价修饰调节1．概念：通过其它的酶对其结构进行共价修饰，从而使其在活性形式和非活性形式之间相互转变。

2．常见修饰类型：磷酸化与去磷酸化；腺苷酸化与脱腺苷酸化；尿苷酸化与脱尿苷酸化；泛素化；类泛素化3．例子：糖原磷酸化酶——磷酸化形式有活性（葡萄糖）n+Pi→（葡萄糖）n-1+1-磷酸葡萄糖4．常见磷酸化部位：丝氨酸/苏氨酸，酪氨酸和组氨酸四．酶活性调节方式要能判断所举酶的例子是什么类型调节1. 别构调节2. 激素调节：如乳糖合酶修饰亚基的水平是由激素控制的。

妊娠时，修饰亚基在乳腺生成。

分娩时，由于激素水平急剧的变化，修饰亚基大量合成，它和催化亚基结合，大量合成乳糖。

3. 共价修饰调节：如糖原磷酸化酶、磷酸化酶b激酶4．限制性蛋白水解作用与酶活性控制。

如酶原激活5．抑制剂和激活剂的调节6．反馈调节7．金属离子和其它小分子化合物的调节8．蛋白质剪接五．反馈调节（概）：催化某物质生成的第一步反应的酶的活性，往往被其终端产物所抑制。

这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。

A-J ：代谢物实线箭头：酶促催化步骤虚线箭头：反馈抑制步骤代谢途径的第一步和共同底物进入分支途径的分支点是反馈抑制的最为重要的位点。

酶六章酶的固定化

酶六章酶的固定化

迄今已有许多酶用离子结合 法固定化，例如1969年最早应用 于工业生产的固定化氨基酰化酶 就是使用多糖类阴离子交换剂 DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。
（二）化学结合法
——1 共价结合法 ——2 交联法
共价偶联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相
N OH
O
O O CO N
O
P-NH2
O CO NH P
CH2COOH SOCl2
CH2COCl
P-NH2 pH8~9
CH2CONH P
多胺载体
CH2NH2 Cl-CS-Cl
CH2 N C S P-NH2
HO CH2 N C NHP
CH2COOH
MeOH HCl
CH2COOMe NH2NH2
CH2CON3 P-NH2
O OH O CH2CH2 O S OH
O
O OH O CH2CH2 O S OH
O
NH2 N N-P
无机载体
——可采用直接法和涂层法（用 活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖 涂层）
O P-NH2
Si (CH2)3NH CH(CH2)3CHO
O
(1)
OHC-(CH2)3CHO
O Si (CH2)3NH CH(CH2)3CH=N-P O
O Si OH H2N(CH2)3Si (OEt)3 O Si OH
制备固定化酶要根据不同情况 （不同酶、不同应用目的和应用环境） 来选择不同的方法，但是无论如何选 择，确定什么样的方法，都要遵循几 个基本原则
原则1
——必须注意维持酶的催化活性 及专一性，保持酶原有的专一性、 高效催化能力和在常温常压下能 起催化反应的特点。

生物化学 6 酶化学

生物化学 6 酶化学

目前将酶定义为：具有高效性和专一性的生物 催化剂。分为两类：蛋白酶、核酶
（或酶是一类由活细胞产生的，具有高效性和专一性以 蛋白质为主要成分的生物催化剂。）
6.1 酶的概念与特点 6.1.2 酶的特点
酶和一般催化剂的共同点： 1.在反应前后没有质和量的变化； 2.只能催化热力学上允许进行的化学反应； 3.只能加速可逆反应的进程，而不改变平衡点。 酶和一般催化剂的不同点（即酶的重要特点)： 1.酶具有高效性； 2.酶具有高度专一性； 3.酶促反应条件温和（对外界环境高度敏感性）； 4.酶活力可调节控制（可调性）。
6.5 酶的作用机制 酶的催化作用与活化分子
任何反应都需要一定的能量，有了能量分子就能活化
成活化分子。
1. 活化分子：能量达到或高于分子平均能量的分子。
2. 活化能：分子由基态到活化态所需的能量。
在一个反应体系中，反应所需的活化能越高，活化分子越少， 反应速度越慢；相反，反应所需的活化能越低，活化分子越多， 反应速度越快 。 酶促反应中所需活化能是高还是低？
锁钥假说:象是具有刚 性结构的，酶表面具 有特定的形状。酶与 底物的结合如同一把 钥匙对一把锁一样。 诱导契合假说:该学说 认为酶表面并没有一 种与底物互补的固定 形状，而只是由于底 物的诱导才形成了互 补形状。

6.4 酶的专一性 6.4.2 酶专一性的假说
羟 肽 酶 的 诱 导 契 合 模 式
酶由活细胞产生，分胞外酶和胞内酶。与颗粒体结合分布在各个部位参 与体内的代谢，由于酶的特性，酶的催化反应受各种因素的影响与调节， 如温度、PH、抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素 控制等。
6.2 酶的化学本质与组成 6.2.1 酶的化学本质
1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为 蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。 酶是蛋白质的证据：从化学组成和理化性质看。 1982年T.Cech发现了第一个有催化活性的天然RNA—— ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了 真正的RNA催化剂。 核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有 关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。

酶工程第6章酶的结构与功能

酶工程第6章酶的结构与功能

3．X-光衍射分析法
用X射线衍射研究蛋白质的构象时，蛋白质 必须结晶。用波长很短的X射线（λ=0.154nm）照 射蛋白质晶体，发生散射，底片曝光后，得到衍 射图，再经计算机处理，绘出电子密度图，从中 构建出三维分子图像。
通过多种方法相互印证，可得出正确的结论。
肌红蛋白的X射线衍射图
部 分肽链的电子密度肌红蛋白分子中 图
某些常用的修饰剂
鉴别化学修饰剂是否已经 引入酶活性中心的标准
a．酶活性的丧失程度与修饰的程度成正比。 b．底物或可逆抑制剂可保护共价修饰剂的抑制作用。
分析化学修饰结果时 应注意的问题
对化学修饰实验得出的结论应非常慎重，因为 可能被修饰的基团位于活性中心以外的附近，由于 空间位阻使得底物无法进入活性中心，从而表现出 酶失去活性。活性中心往往有多个与底物结合的基 团，修饰其中的一个往往不能使酶失去活性，可能 导致结合力减弱，也可能改变被结合底物的专一性。
木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
通过动力学实验证实，还有一个组氨酸残基的 咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化部位（木瓜 蛋 白 酶 共 有 212 个 氨 基 酸 ， 有 His81 和 His159 两 个 His）。Husain和Lowe用1,3-二溴丙酮修饰木瓜蛋白 酶，在pH5.6，1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白 酶的活性。对修饰后的酶进行氨基酸分析，发现少 一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮（2-14C）的修饰实验 中，发现修饰剂连接了Cys-25和His-159两个残基， 因此知道了这两个基团之间的距离在 5 以内。这个 结论通过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。
第六章 酶的结构和功能
一、酶的活性中心 二、酶活性中心化学基团的鉴定 三、组成酶活性中心的重要化学基团 四、酶促化学修饰和酶活性调节 五、酶的空间结构与功能的关系 六、酶催化作用的机制 七、羧肽酶A催化作用的机制

【生物化学】第六章 酶促反应动力学

【生物化学】第六章 酶促反应动力学
2
本章纲要
一、化学动力学基础 二、底物浓度对酶反应速度的影响 三、抑制剂对酶反应速度的影响 四、激活剂对酶反应速度的影响 五、温度对酶反应速度的影响 六、pH对酶反应速度的影响
一、化学动力学基础
了解反应速率及其测定 反应分子数和反应级数
一、化学动力学基础
㈠ 反应速率及其测定
单位时间内反应物的减少量或生成物的增加量用瞬时速率表示, 单位: 浓度/时间,研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准。
第六章 酶促反应动力学
Enzyme kinetics
概述
研究酶促反应的速率以及影响此速率的各 种因素的科学,是酶工程中的重要内容
研究酶结构和功能的关系以及酶的作用机 制，需要动力学提供实验数据
发挥酶促反应的高效率，寻找最为有利的 反应条件
酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制 具有理论研究的意义和实践价值
C是反应物的浓度变化, K为速率常数，是时间的倒数 基元反应:反应物分子在碰撞中一步直接转化为生成物分子的反应。
一、化学动力学基础
2. 反应级数：实验测得的表示反应速率与反应浓度之间关系的概念。 对于基元反应
1.一级反应单分子反应符合V=KC的反应
蔗糖+水
葡萄糖+果糖 V=KC蔗糖C水
由于水的浓度变化影响可忽略（非限制性因素）则V=KC蔗糖
二、底物浓度对酶反应速度的影响
㈠ 中间络合物学说
L.米歇利斯和L.M.门腾(1913)基于酶被底 物饱和的现象，提出“中间产物”学说:
酶与底物反应时，通过特异识别作用，先 形成酶底物复合物，然后再形成产物和酶分 子，酶分子重新结合底物。
该学说已得到大量实验证实
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酶结构和功能课件

酶结构和功能课件

2. 酶的调节中心
二. 酶的功能结构
有些酶的分子表面除了活性中心外，还具有重要的 功能部位——调节中心，它可以与小分子的代谢物相结 合，使酶分子的构象发生改变，从而影响酶的活性。
这种作用叫变构效应(又叫别构效应)，具有变构效 应的酶叫变构酶，引起变构的小分子物质叫变构剂(调 节物)。
2. 酶的调节中心
1. 酶的组成成分
辅因子的作用：
一.酶的化学结构
2. 酶的聚合状态
一.酶的化学结构
由酶的聚合状态，酶可分为三类：
单体酶 —— 酶蛋白仅有一条多肽链。
寡聚酶 —— 酶蛋白是寡聚蛋白质，由几个至几十个亚 基组成，以非共价键连接。
多酶复合体 —— 由几个酶聚合而成的复合体。
1. 酶的活性中心
二. 酶的功能结构
对于结合酶，辅因子常常是活性中心的组成部分。
1. 酶的活性中心 （2）酶的活性中心的特点
二. 酶的功能结构
都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形状， 但不是刚性的，而具有一定的柔性。
活性中心为非极性的微环境，这有利于与底物的结合。
活性中心内还含有少数极性基团，它们直接与底物相 作用。
1. 酶的活性中心 （2）酶的活性中心的特点
二. 酶的功能结构
1. 酶的活性中心
二. 酶的功能结构
活性中心
催化部位
底物的敏感键在此被打断或 形成新的键，从而发生一定 的化学反应。一个酶的催化 部位可以不止一个。
结合部位
底物在此与酶分子结合。 一个酶的结合部位又可以 分为各种亚位点，分别与 底物的不同部位结合。
1. 酶的活性中心
二. 酶的功能结构
变构酶的 v-[S] 的关系不符合米氏方程，所以其 曲线不是双曲线型。

酶命名与分类

酶命名与分类
殊要求和选择。 类别：绝对专一性和相对专一性
（2） 立体异构专一性 概念：酶除了对底物分子的化学结构有
要求外，对其立体异构也有一定的要求
类别：旋光异构专一性和几何异构专一 性
绝对专一性：有些酶只作用于一 种底物，催化一个反应， 而不作用于 任何其它物质。
如：相过对氧专化一氢性酶：底这物类：酶过对氧结化构氢相近 的一类琥底珀物酸都脱有氢作酶用底。物包：括琥键珀专酸一性 和基团专一性。 基键团专专一一性性：：只化要学求键作用于一定的化学 键，而对键两键端一的端基的团基无团严格的要求。
例如，脂肪酶催化的脂的水解反 应：
R C O O C H 2 C H 3H 2 O R C O O HC H 3 C H 2 O H
4.裂合酶：催化从底物上移去某 些基团而形成双键的非水解性反应及 其逆反应的酶。
主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨 酶等。
例如， 延胡索酸水合酶催化的 反应。
H O O C C H = C H C O O H H 2 OH O O C C H 2 C H C O O H
O H
5.异构酶：催化同分异构体的相 互转变，即底物分子内基团或原子的 重排过程的酶。
例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的 反应。
CH2OH O OH
OH
OH OH
6-磷酸葡萄糖
CH2OH
CH2OH
O OH
OH
OH
6-磷酸果糖
6.合成酶：又称为连接酶，能够催 化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成 反应。这类反应必须与ATP分解反应 相互偶联。
组3酶.分酸氨子碱酸中催的可化咪作为：唑酸基硷：催化的功能基团
（1）一p般K值都约是为广6义.7的-7酸.1，－在碱接催近化中方性式。

酶工程教学大纲

酶工程教学大纲

《酶工程》课程教学大纲总学时数：30一、课程的地位、性质和任务酶工程（enzyme engneering）是生物技术专业的主干必修课，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的一门新的科学技术，在生物技术人才培养中处于至关重要的地位。

它涉及细胞工程、基因工程、发酵工程、生物分离工程和化学工程等诸多学科，主要内容包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶和细胞固定化以及酶的分子工程。

学生通过酶工程的学习，能够掌握酶的生产与分离纯化的基本理论、基本技术以及自然酶、化学修饰酶、固定化酶的研究和应用，了解酶在各行各业中的最新发展及研究趋势。

二、课程教学的基本要求学生通过酶工程的学习，应熟悉从应用目的出发研究酶，在一定生物反应装置中利用酶的催化性质的研究路线，掌握酶的生产与应用的基本理论、基本技术、酶的分离纯化、固定化酶以及酶的化学修饰的研究和应用，进一步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势，在以后的毕业环节和工作中能够自觉地应用这些技术方法来指导自己的工作。

本课程理论课30学时，于本科三年级第二学期开设。

讲授方式：1．讲授2．利用CAI课件三、各章主要内容、学时分配及教学要求第一章绪论 2学时【单元目标】1．了解酶工程的研究意义；2．掌握酶工程的概念及研究内容。

【授课内容】一．酶与酶工程发展简史（一）酶学研究简史（二）酶工程研究简史二. 酶工程简介1.酶工程2.组成3.分类第二章微生物发酵产酶 4学时【单元目标】1.掌握酶生物合成的调节类型及调节机制2.了解产酶微生物的分离和选育方法3.了解动植物细胞与微生物细胞发酵产酶的异同【授课内容】第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成（一）RNA的生物合成--转录(transcription) （二）蛋白质的生物合成--翻译(translation) 1．翻译2．翻译过程即蛋白质的合成过程二、酶生物合成的调节（一）基因调控理论（二）酶合成调节的类型1.诱导 (induction)2.阻遏 (repression)（三）酶合成的调节机制三、提高酶产量的策略（一）菌种选育1.诱变育种2.基因工程育种（二）条件控制第二节酶发酵动力学一、细胞生长动力学（Monod方程）二、产酶动力学(一) 酶生物合成的模式1.生长偶联型2.部分生长偶联型3.非生长偶联型(二) 产酶动力学第三节微生物发酵产酶一、产酶微生物的分离和选育二、微生物发酵产酶方法1.固体培养2.液体培养3.固定化细胞三、微生物酶的类型1.胞外酶2.胞内酶第三章动、植物细胞培养产酶2学时一、动植物细胞与微生物细胞主要特性差异二、植物细胞培养产酶1.植物细胞培养的特点、提取法缺点2.培养基特点3.培养方法4.培养条件的影响与控制5.植物细胞培养产酶实例三、动物细胞培养产酶1.动物细胞培养的特点2.培养基3.培养方法4.培养条件的影响与控制第四章酶的提取与分离纯化 12学时【单元目标】1．掌握酶分离纯化的常用方法及其原理2．掌握几种常用的电泳方法及操作步骤2．了解酶的纯化方案的设计【授课内容】第一节酶的分离4学时一、发酵液预处理(一)发酵液的相对纯化(二)发酵液的固液分离二、细胞破碎（一）细胞壁组成（二）细胞破碎的方法（三）细胞破碎确认三、酶的提取(extraction)（一）理想提取液具备的条件、目标原则（二）提取方法四、离心分离（一）基本原理（二）离心机的种类（三）常用离心方法1．差速离心2．密度梯度离心3. 等密度梯度离心又称沉降平衡离心（四）应用五、沉淀分离（根据溶解度的不同）（一）盐析沉淀法（改变离子强度）（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）（三）等电点沉淀(isoelectric precipitation) （四）有机聚合物沉淀法（五）选择性变性沉淀法六、萃取（extraction）分离（一）溶剂萃取法（二）双水相萃取技术（三）超临界流体萃取（四）反胶团萃取第二节酶的精制5学时一、膜分离技术（一）扩散膜分离（二）加压膜分离（三）电场膜分离二、层析法（一）吸附层析（adsorption chromatography）1.原理2.吸附剂3.洗脱剂4.应用（二）凝胶过滤层析)(gel filtration chromatography)1.基本原理2.凝胶的种类和性质3.操作4.应用（三）离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC）1. 原理2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程3. 操作4. 应用- 制备纯化生物大分子（四）疏水层析（hydrophobic interaction）1、原理2. 吸附剂3. 操作4. 应用（五）亲和层析(affinity chromatography)1. 原理2. 基质的选择3. 配体的选择4. 偶联（亲和吸附剂的制备）5. 操作及应用(六) 高效（压）液相层析（HPLC：high performance（pressure）liquid chromatography)1. 基本原理2. 分类3. 色谱仪组成第三节电泳一、电泳的基本理论1. 原理2. 电泳的分类3. 电泳常用设备二、聚丙烯酰胺凝胶电泳1.原理2.分离效应三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 原理2. 操作四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )1. 原理2. 操作3. 应用第四节酶的浓缩、干燥与结晶2学时一、酶的浓缩(一)蒸发浓缩(二)超滤浓缩(三)吸水剂(四)反复冻融浓缩(五)沉淀法二、酶的干燥三、酶的结晶（一）结晶的条件（二）结晶的方法第五节纯化方案的设计与评价１学时一、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据（二）纯化方法的排序二、纯化方案的评价（一）酶活力测定（二）蛋白质浓度测定（三）提纯倍数与回收率第五章酶分子的化学修饰 2学时【单元目标】1．掌握酶活性中心的概念及共性2．了解酶化学修饰的目的及原理3．了解酶化学修饰的种类及应用【授课内容】第一节酶的活性中心一、活性中心的概念二、活性中心的共性三、研究酶活性中心的方法1.物理学方法2.化学修饰法3.蛋白质工程第二节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因2.改变酶特性有两种主要的方法3.酶化学修饰的概念二、酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围第三节酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境第四节酶化学修饰的设计一、充分认识酶分子的特性二、修饰剂的选择三、反应条件的选择第五节酶化学修饰的种类及应用一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）1．定义2．修饰剂3．应用（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）1．定义2．侧链基团修饰剂3．几种重要的修饰反应（三）交联修饰（交联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（二）氨基酸置换修饰（三）金属离子置换修饰第六章酶与细胞的固定化 2学时【单元目标】1．掌握固定化酶和固定化细胞的定义及特点2．了解固定化酶和固定化细胞的性质及应用【授课内容】第一节酶与细胞的固定化一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点1.固定化酶 (immobilized enzyme)2.固定化细胞（immobilized cell）二、固定化方法（一）酶的固定化方法1.吸附法（adsorption）2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）3.交联法（crosslinking）4.包埋法(encapsulation)（二）各种固定化方法的优缺点比较（三）细胞的固定化方法1.固定化细胞的分类2.固定化方法（四）原生质体的固定化方法第二节固定化酶和固定化细胞的性质与表征一、固定化酶的性质二、固定化细胞的性质三、固定化酶（细胞）的评价指标第三节固定化酶与固定化细胞的应用一、在工业生产上的应用1．氨基酰化酶（Aminoacylase）2．葡萄糖异构酶二、固定化酶在医学上的应用1．消血栓2. 人工肾三、在分析检测中的应用1. 酶传感器1）酶传感器的原理2）酶传感器的应用2. 酶联免疫测定第七章酶反应器 2学时【单元目标】1．了解酶反应器的几种类型2．了解酶反应器的设计原理及操作【授课内容】第一节酶反应器的特点与类型一、酶反应器的类型（一）搅拌罐型（Stirred Tank Reacter, STR）（二）固定床型（也称填充床，Packed Bed Reactor, PBR ）（三）流化床型(Fludized Bed Reactor, FBR)（四）膜式反应器(Membrane Reactor)（五）鼓泡塔型反应器二、酶反应器的发展第二节酶反应器的设计与选择一、酶反应器的设计1.设计目的2.设计原理（依据）二、酶反应器的选择（一）酶的应用形式（二）底物的物理性质（三）反应操作要求（四）酶的稳定性（五）应用的可塑性及成本三、酶反应器的操作第八章酶的应用 4学时【单元目标】1．了解酶在医药方面的应用2．了解酶在食品方面的应用3．了解酶在化工方面的应用4. 了解酶在环境保护方面的应用5. 了解酶在生物技术领域的应用【授课内容】第一节酶在医药方面的应用第二节酶在食品方面的应用第三节酶在化工方面的应用第四节酶在环境保护方面的应用第五节酶在生物技术领域的应用四、使用教材与主要参考书目录1教材《酶工程》（第二版）作者：郭勇科学出版社 20042 主要参考书目郭勇现代生化技术，华南理工大学出版社， 1996郭勇酶的生产与应用，化学工业出版社个，2003罗贵民酶工程，化学工业出版社，2002张树政酶制剂工业，科学出版社，1984邹国林酶学，武汉大学出版社， 1997五、考核方法和成绩构成本课程为考试考核，包括两部分：期中及平时为30%，期末70%。

酶工程第章酶的结构和功能

酶工程第章酶的结构和功能

羧肽酶A活性中心的结构
羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。 当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨基酸时 （苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反 应速度很快。但是当有这些较大疏水基团的氨基 酸残基进入亚位点3～6时，就会减低酶对这些底 物的亲和力。说明羧肽酶A对底物的识别和结合 有多个位点。同时，苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争 性抑制实验证实，还有一个组氨酸残基的 咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化部位（木瓜 蛋 白 酶 共 有 212 个 氨 基 酸 ， 有 His81 和 His159 两 个 His）。Husain和Lowe用1,3-二溴丙酮修饰木瓜蛋白 酶，在pH5.6，1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白 酶的活性。对修饰后的酶进行氨基酸分析，发现少 一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮（2-14C）的修饰实验 中，发现修饰剂连接了Cys-25和His-159两个残基， 因此知道了这两个基团之间的距离在 5 以内。这个 结论通过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。
差示标记法
胰蛋白酶的差示标记
胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水 解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性基团 存在。ψ胰蛋白酶（Lys6-Ile7之间断裂成为β胰蛋 白 酶 ； Lys6-Ile7 和 Lys131-Ser132 两 处 断 裂 成 为 α 胰 蛋 白 酶 ； Lys6-Ile7 、 Lys131-Ser132 和 Lys176Asp177三处断裂成为ψ胰蛋白酶）失去了水解碱 性氨基酸的羧基形成的肽键的能力，而保留了一般 的酯酶活性，估计Asp177的β－COOH可能与结 合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。
一、酶的活性中心
1．酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催 化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可以在肽 链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘 旋，使它们在空间上接近，形成活性中心（或称活 性部位）。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结 合底物的任务，有些执行催化反应的任务。我们把 组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持 整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。

第六章_酶分子修饰

第六章_酶分子修饰
（1）提高酶活力（空间构象改变）
一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为 原来的2.25倍。
一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活 提高原来的 5.1倍。
一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高 0.30倍
（2）增加酶的稳定性
酶的保存或使用一段时间后，由于各种因素影响，原 来完整的空间结构受到破坏，酶活力降低，甚至完全 丧失催化能力。
聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物：
是MPEG的羟基与琥珀酰亚胺类物质反应。在pH7-10时， 对酶的氨基进行修饰。
聚乙二醇胺类衍生物：
是MPEG的羟基与胺类化合物反应生成的。可以对酶的羰 基进行修饰。
聚乙二醇马来酸酐衍生物：
MPEG的羟基与马来酸酐反应生成共聚物（PM），其中 马来酸酐通过酰胺键对酶分子的氨基进行修饰。
3）修饰：
活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一 定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反 应，使两者以共价键结合。 4）分离：
通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度 的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰 酶。
右旋糖苷————（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷
三、大分子修饰的作用
酶对人体是一种外源蛋白，当经注射进入人体后 会成为抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次进 入体内，抗体就会与作为抗原的酶特异结合，而使 酶失去催化能力。
抗体与抗原间特异结合是由于它们之间特定分子结构引 起的。用酶分子修饰法使酶的结构产生改变，抗体、抗 原就不再特异结合，可能降低或消除其抗原性。
利用水溶性大分子对酶进行修饰可降低或消除酶的抗原 性。
2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB）和4－硝基苯硫 绿可以比较专一地对吲哚基进行修饰，但也可以 与巯基反应。

酶工程第六章 固定化酶

酶工程第六章 固定化酶

酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合 法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。
6.3.1吸附法
吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶 分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的 方法，是固定化中最简单的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相 互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基
团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用
最多的一种。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共
聚体和聚丙烯化生成叠氮化合物，再与酶分子上
的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等

其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项
研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新 技术。
6.1 固定化酶的定义与优点
所谓固定化酶(immobilized enzyme)， 是指在一定的空间范围内起催化作用，并 能反复和连续使用的酶。
固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同 时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。
（1）物理吸附法
物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶
直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。
是制备固定化酶最早采用的方法。

如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此
法进行固定化。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶 原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、 多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。

酶的结构与功能ppt课件

酶的结构与功能ppt课件
的不同需求，在许多代谢通路的关键之处，都有同 工酶存在。
4 同工酶与癌机理研究：
肿瘤发生时基因表达紊乱，产生一些正常组织没有的 表达产物，包括一些胎儿型同工酶 • 血清酸性磷酸酶（acid phosphadase, ACP）升高：前列腺癌 • 血清γ-谷氨酰基转移酶同工酶（γ-GT）、M2型丙酮酸激酶 同工酶 ：肝癌的诊断
一条肽链或一个亚基上含有两种或两种以上的酶催化 活性。一般是基因融合的产物。可以单体存在，也可形成寡 聚酶。例如：
Asp激酶I - 高丝氨酸脱氢酶(融合体)
( EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3) • 来自大肠杆菌，双头酶 • 一般以四聚体形式存在，其中每一亚基都有活性 • 以蛋白酶切开后肽链后，N、C末端各有不同酶活性。 • 其它多酶融合体：
乙醇和CO2 • 1926 ~1936年Sumner等从到刀豆中得到脲酶结晶，提出酶
的本质是蛋白质 • 1982年后，Cech和Altaman发现RNA具有催化功能
——ribozyme（核酶） • 90年代发现某些DNA、抗生素也有催化功能。
• 生物催化剂:具有催化功能的生物物质。 • 酶: 具有催化功能的蛋白，是生物催化剂的一种。
2. 含不同亚基:
(1) 天冬氨酰转氨甲酰基酶(ATCase):
• ATC酶是由6个调节链和6个催化链构成的别构酶
• 每3个催化链() 构成一个催化亚基：
负责与底物Asp及氨甲酰磷酸结合，有催化功能,
每2个调节链(β ) 构成一个调节亚基：
与效应物ATP(+)和CTP(-) 结合，调节酶催化活力
工酶。 多基因位点同工酶：由染色体上不同位点的基因编码的蛋白 复等位基因同工酶：不同个体同一位点基因不同
同一个体中等位基因的两个成员不同 2 次级同工酶（secondary isozyme)：翻译后同工酶
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木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
通过动力学实验证实，还有一个组氨酸残基的 咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化部位（木瓜 蛋白酶共有212个氨基酸，有His81和His159两个 His）。Husain和Lowe用1,3-二溴丙酮修饰木瓜蛋白 酶，在pH5.6，1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白 酶的活性。对修饰后的酶进行氨基酸分析，发现少 一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮（2-14C）的修饰实验 中，发现修饰剂连接了Cys-25和His-159两个残基， 因此知道了这两个基团之间的距离在 5 以内。这个 结论通过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。
酶的活性中心示意图
A、B、C 为活性中心的必需基团
酶分子中氨基酸残基的分类
1960年，Koshland将酶分子中的氨基酸残基或 其侧链基团分成4类：接触残基（直接与底物接触， 参与结合或催化的残基），辅助残基（对接触残基 的功能起辅助作用的残基，也位于活性中心），结 构残基（维持构象的残基，此为活性中心以外的必 需基团），非贡献残基（或称非必需残基，非必需 只是对酶发挥活性而言，它们可能有其他作用，如 识别自身物质、运输、防止降解等）。
酶活性部位微环境的影响
由于酶活性部位微环境的影响，活性中心的基 团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性中心 以外的基团的反应性高或低。如3-磷酸甘油醛脱氢 酶的活性中心的Ser能优先地被14C-碘乙酸标记； 牛胰核糖核酸酶活性中心的His能优先地被碘乙酸 标记，其Lys-41的ε－NH2可优先地被氟二硝基苯标 记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂 的反应性很低。
胰蛋白酶的差示标记
Eyl和Inagami的实验证明了上述推测。他们用 苯甲脒（benzamidine，C6H5C(=NH)NH2）作为β胰 蛋白酶的竞争性抑制剂，以1-乙基-3-二甲氨丙基碳 二亚胺为缩合剂（1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide，C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2），以 甘氨酰胺（glycine amide）为修饰剂，以差示标记法 证明了Asp177是结合底物的一个基团。酶的羧基与 甘氨酰胺以酰胺键结合后几乎完全抑制了酶水解Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（N-α-benzoyl-Larginine ethyl ester）的能力。
各种类型残基举例
接触残基： R1、R基： R3、R5、R7
辅助残基： R4
结构残基 ： R10、R162、 R169
2．酶活性中心的拓扑学
酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条 沟槽，形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不 同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的 某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基 团靠近。亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与 疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残 基亲合。
（1） 使用非特异性试剂 对特殊基团的标记
非特异性试剂可以修饰特定的某种基团， 但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果 某种基团只存在于活性中心，而其他部位没有， 就可以用非特异性试剂修饰。
木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
木瓜蛋白酶（papain）分子中有7个半胱氨酸残 基，其中的6个形成3对二硫键，只有一个以自由巯基 的形式存在于活性中心（Cys22-63，Cys56-95， Cys153-200，自由Cys25；编号从N端开始往C端进 行）。在这种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来 修饰，如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性 中心无任何特殊亲和力，但由于这种特殊情况，仍然 得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结果。
羧肽酶A活性中心的结构
羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。 当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨基酸时 （苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反 应速度很快。但是当有这些较大疏水基团的氨基 酸残基进入亚位点3～6时，就会减低酶对这些底 物的亲和力。说明羧肽酶A对底物的识别和结合 有多个位点。同时，苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争 性抑制剂。
差示标记法
胰蛋白酶的差示标记
胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水 解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性基团 存在。ψ胰蛋白酶（Lys6-Ile7之间断裂成为β胰蛋 白酶；Lys6-Ile7和Lys131-Ser132两处断裂成为α 胰蛋白酶；Lys6-Ile7、Lys131-Ser132和Lys176Asp177三处断裂成为ψ胰蛋白酶）失去了水解碱 性氨基酸的羧基形成的肽键的能力，而保留了一般 的酯酶活性，估计Asp177的β－COOH可能与结 合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。
羧肽酶A活性中心 的结构示意图
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二、酶活性中心化学基团 的鉴定
常用的方法有:
化学修饰法 反应动力学法 x-光晶体衍射法
1.化学修饰法
酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可 以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、 羧基等。如果一个基团是必需的，则被修饰后 酶活性会大大下降，甚至完全失活。
要充分利用高反应性的情况。
（2）差示标记法
这种方法是非特异性试剂标记法的一个发 展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性 中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的 基团，然后透析除去保护剂（即竞争性抑制剂 或底物），再用同位素标记的非特异性试剂修 饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基 团位于活性中心。
第六章 酶的结构和功能
一、酶的活性中心 二、酶活性中心化学基团的鉴定 三、组成酶活性中心的重要化学基团 四、酶促化学修饰和酶活性调节 五、酶的空间结构与功能的关系 六、酶催化作用的机制 七、羧肽酶A催化作用的机制
一、酶的活性中心
1．酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催 化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可以在肽 链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘 旋，使它们在空间上接近，形成活性中心（或称活 性部位）。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结 合底物的任务，有些执行催化反应的任务。我们把 组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持 整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。