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发酵⼯程实验讲义发酵⼯程实验（适合发酵⼯程原理与技术）张建国⽤前沿发酵⼯程（Fermentation Engineering）属于⽣物技术的范畴，⽣物技术⼜称⽣物⼯艺学现代⽣物技术作为⼀门新兴的⾼科技术产业，它的⽣命⼒在于他对社会经济和发展的各个⽅⾯都带来了极⼤冲击和影响。
发酵⼯程是指在最适发酵条件下，发酵罐中⼤量培养细胞和⽣产代谢产物的技术。
发酵⼯程由于涉及到⽣物催化剂，因⽽与化学反应有关。
由于⽣物技术的最终⽬标是建⽴⼯业⽣产过程为社会服务，因⽽该⽣产过程可称为⽣物反应过程（亦称为⽣化反应过程）。
在发酵技术中⼀般包括微⽣物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利⽤固定化酶，固定化细胞所做的反应器加⼯底物（即有⽣化催化剂参加），以及培养加⼯后产物⼤规模的分离提取等⼯艺。
主要是在⽣物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。
如酸碱度、湿度、底物浓度、通⽓量以及保证⽆菌状态等研究内容。
⽣物技术产品具有多样性，各个学校的教学资源和课时不同，所进⾏的实验种类不同。
本实验内容根据本校的具体条件进⾏安排。
安排的思路是以最简洁有效的⽅式针对发酵过程的重要要素进⾏实验，便于学⽣对教学内容有个较好的认识，理顺学习思路，为进⾏社会科学实践打下良好基础。
第⼀篇野⽣型菌株的筛选经典的发酵产物来⾃微⽣物，⼟壤是微⽣物的⼤本营。
⽣产菌株的选育源头都来⾃于⾃然界。
如何从⾃然界中筛选⽬的微⽣物，可以根据⽬的微⽣物和产物的特性作为筛选条件，进⾏筛选提⾼筛选效率，从⽽有效的解决菌株从⽆到有的问题。
实验⼀产淀粉酶菌株的筛选（4学时）⼀．实验⽬的筛选⼀株能够合成分解淀粉的微⽣物。
⼆．原理⾃然界微⽣物种类繁多，有些微⽣物能够以淀粉作为碳源进⾏⽣长繁殖是因为它们能够合成分泌淀粉酶，因此我们能够从⾃然界中定向分离出合成淀粉酶的微⽣物。
当能合成淀粉酶的微⽣物在固体培养基中⽣长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围，将菌落周围的淀粉⽔解成为⼩分量的糊精、聚糖和单糖。
发酵工程资料1、染菌率：总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与总投料批（次）数之比的百分率。
染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌的批次数在内。
这是习惯的计算方法，也是我国的统一计算方法。
2、微生物生长曲线：在适宜的培养基中接入少量微生物，以后每隔一定时间取样测定细胞数目，以细胞群体量的对数对培养时间作图绘制出变化曲线。
3、临界溶氧浓度及其变化曲线：CCr: 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。
CL：溶解氧浓度 CCr ：临界溶解氧浓度只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量。
如果溶氧浓度低于临界值：则菌体代谢受到干扰。
4、自然选育：在发酵过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，直接进行筛选，选育出优良菌种的过程。
5、诱变育种：通过诱变剂处理菌种的突变几率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。
（速度快、收效大、方法简单。
6、辅料分批培养：根据菌体生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。
7、抗生素及其营养缺陷型突变株抗生素是生物在其生命活动过程中产生的、在低微浓度下能选择性地抑制或影响他种生物功能的相对分子量低的化学物质。
营养缺陷型：某一野生型菌株因发生基因突变而丧失一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在培养基上正常生长繁殖的变异类型。
8、前体及其作用10、前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
作用：前提必须通过产生菌的生物合成过程，才能参加到分子结构中。
在一定条件下，前提可以起到控制菌体代谢产物的合成方向和增加产量的作用。
9、次级发酵中的分叉中间体:在微生物代谢过程中，一些中间代谢产物a-氨基已二酸一样，既可以被微生物用来合成初级代谢产物，也可以用来合成次级代谢产物，这样的中间体被称为分叉中间体。
第3节发酵工程及其应用一、发酵工程的基本环节发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面。
1．选育菌种：性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。
2．扩大培养：工业发酵罐的体积很大，接入的菌种总体积也较大，因此在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。
3．配制培养基：在菌种确定之后，要选择原料制备培养基。
培养基的配方要经过反复试验才能确定。
4．灭菌：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。
一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。
因此，培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
5．接种：扩大培养的菌种和灭菌后的培养基加入发酵罐中。
大型发酵罐有计算机控制系统，能对发酵过程中的温度、pH、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制。
6．发酵罐内发酵：在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。
还要及时添加必需的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。
7．分离、提纯产物：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥得到产品。
如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
二、发酵工程的应用1．在食品工业上的应用(1)生产传统的发酵产品，如酱油、各种酒类。
(2)生产各种各样的食品添加剂，如通过黑曲霉发酵制得的柠檬酸，由谷氨酸棒状杆菌发酵生产味精。
(3)生产酶制剂，如α淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶等。
2．在医药工业上的应用基因工程、蛋白质工程等的广泛应用给发酵工程制药领域的发展注入了强劲动力。
3．在农牧业上的应用(1)生产微生物肥料。
微生物肥料利用了微生物在代谢过程中产生的有机酸、生物活性物质等来增进土壤肥力，改良土壤结构，促进植株生长，常见的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。
(2)生产微生物农药。
微生物农药是利用微生物或其代谢物来防治病虫害的。
发酵工程讲稿今天本组所讲的内容是发酵工程，接下来我将从以下四个方面来向大家介绍发酵工程的相关内容。
首先让我们一起来了解一下什么叫发酵工程。
发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。
微生物是发酵工程的灵魂，所以发酵工程又叫微生物发酵工程，近年来，对于发酵工程的生物学属性的认识愈益明朗化，发酵工程正在走近科学，发酵工程最基本的原理是发酵工程的生物学原理。
接下来是发酵工程的基本步骤，发酵工程的基本步骤主要由以下五个方面组成，菌种的选育，培养基的配制，接种和扩大培养，生产活性的诱导，还有产品的分离与提纯。
这是发酵工程的基本流程概念图。
在操作发酵的基本步骤时有以下四方面是值得我们注意和思考的，一、菌体的选育有两种方式，一种是自然选育，一种是诱变育种，其中诱变育种以其操作简便、速度快和收效大的优点，成为沿用至今的一种重要的、广泛应用的微生物育种方法。
二、在配置培养基时所用的原料有碳源，氮源，生长因子，无机盐和水。
要遵循的原则是目的要明确，营养要协调，PH要适宜。
三、发酵过程中不能有杂菌污染，不仅要对培养基进行灭菌，还要对发酵装置进行灭菌，通入的空气也要进行灭菌。
灭菌不仅要杀死杂菌细胞，还要杀死芽孢和孢子。
四、发酵过程是发酵的中心阶段，其关键是控制发酵的条件，如温度，pH，溶氧，通气量与转速等。
另外，发酵工程的基本步骤还有这样一种分配方式，他们分别被称为上游工程，中游工程，和下游工程。
下面我们就一起来了解一下其主要内容。
上游工程包括优良种株的选育，最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定，营养物的准备等。
中游工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。
这里要有严格的无菌生长环境，包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。
发酵工程（发酵工程第一章）发酵工程：主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。
(1) 有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。
(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。
(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。
微生物发酵技术1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。
”巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。
同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。
利用微生物的特点Use of MicroorganismsPositive（益处）BiomassProductionConversionNegative（危害）PathogensSpoilage一、发酵的定义1、传统发酵2、生化和生理学意义的发酵3、工业上的发酵1、传统发酵最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。
2、生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。
如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。
3、工业上的发酵泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程包括：1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。
发酵工程讲义长江大学生科院生物技术系《发酵工程》讲义第一章绪论教学目的：了解发酵工程的意义及组成，我国发酵工程的发展现状；掌握微生物发酵的纯培养技术和深层培养技术的相关内容及发酵工程发展历史上的五个转折点；掌握发酵工程的产业化及其发展前景。
教学重点、难点：微生物发酵的纯培养技术和深层培养技术；发酵工程的产业化及其发展前景。
发酵工程的意义及组成传统生物技术：抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等。
现代生物技术：基因工程菌发酵，基因工程药物、疫苗及抗体生产。
发酵工业范围：了解发酵工程与现代生物技术的关系发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。
它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。
于它以培养微生物为主，故又称为微生物工程。
发酵工程的组成：从广义上讲，三部分组成，上游工程、发酵工程、下游工程上游工程：- genetics, cell ? - inoculum development -media formulation -sterilization - inoculation 下游工程：- product extraction, purification & assay - waste treatment - by product recovery 发酵的定义： 1.传统发酵发酵最初是来自于拉丁语“发泡”这个词，是指酵母作用于果汁或发芽的谷物时产生二氧化碳的现象。
2.生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。
3.工业上的发酵泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程。
发酵过程的组成部分：典型的发酵过程可划分成六个基本组成部分：繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定；培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长；产物分离和精制；过程中排出的废弃物的处理。
发酵工程的发展历史发酵现象→酿造食品工业→非食品工业→青霉素发酵→抗生素工业→氨基酸,核酸发酵→基因工程菌发酵→动物细胞大规模培养→植物细胞大规模培养→藻类细胞大规模培养→转基因动物第 1 页长江大学生科院生物技术系《发酵工程》讲义传统的微生物发酵技术——天然发酵第一代微生物技术—纯培养技术的建立1675年荷兰Anthony Leeuwenhoek(列文虎克1632~1723)用自制的显微镜，观察到了微生物，包括细菌和酵母。
1857年法国的LouisPasteur(巴斯德1822~1895)第一次证明酒精发酵是活酵母引起的，各种不同的发酵产物是不同的微生物产生的。
被誉为微生物学的鼻祖，发酵学之父。
1897年德国Eduard Buchner(毕希纳1860~1917)将酵母细胞磨碎，得到的酵母汁加糖能产生二氧化碳和酒精，从而阐明了微生物发酵的化学反应本质——酶催化。
1905年德国Rober Koch(柯赫1843~1910) 首先发明了固体培养基，得到了细菌纯培养物，建立了微生物纯培养技术，为发酵工程的建立起了关键作用。
纯培养技术的建立，开创了人为控制发酵过程的时期。
这一时期的产品有：酵母、酒精、丁醇、有机酸、酶制剂等，主要是一些厌氧发酵和表面固体发酵产生的初级代谢产物。
第二代微生物发酵技术—深层培养技术1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基。
─── 40u/ml1943年深层培养：5m3─── 200u/ml当今：100m3─200m3 ─── 5-7万u/ml 青霉素发酵能成功的原因，主要是解决了两大技术问题：通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。
抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。
●随后链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等抗生素相继问世，形成了抗生素工业。
伴随其兴起诞生的大型发酵罐，为发酵工程的发展提供了关键设备。
●20世纪50年代，日本人最早引进“代谢控制发酵技术”用于氨基酸发酵，氨基酸发酵工业得到快速发展；●20世纪60年代，出现了石油发酵，如以石油为原料生产饲料酵母、柠檬酸、水杨酸等。
第三代微生物发酵技术——微生物工程● 1973年美国Boyer和Cohen首先在实验室实现了基因转移，为基因工程开启了通向现实的大门，此后很快在全世界各国的研究人员不但构建高产量的基因工程菌，还使微生物产生出它们本身不能产生的外源蛋白质，而且很快形成了基因工程产品，如胰岛素、生长激素、细胞因子、疫苗、单克隆抗体等。
值得一提的是，1973年人类通过基因工程手段构建了第一个“工程菌”，用它生产出了人生长激素释放抑制因子。
发酵工程发展的转折点：第一个转折点：食品工业→非食品工业第二个转折点：青霉素发酵→ 抗生素工业第三个转折点：代谢控制发酵第四个转折点：发酵原料的改变第五个转折点：基因工程引入发酵我国发酵工程产业化现状及前景1、发酵工程产业化的重要环节发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。
三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。
2、我国发酵工程的发展现状我国发酵工程经过长期发展已有一定基础，并一直持续快速发展。
目前其产品涉及医药、保健、农药、食品、饲料、有机酸等方面。
中国的酿酒业，距今已有数千年的历史渊源。
第 2 页长江大学生科院生物技术系《发酵工程》讲义白酒：是我国特有的、具有悠久历史的传统酒种。
黄酒：是我国最古老的酒种，据史料记载已有6000年左右了。
葡萄酒：1892年华侨张弼士在烟台建立酿酒公司，这是我国第一个新型的葡萄酒酿造厂。
目前我国葡萄酒工厂已有近八十家。
2003年葡萄酒年产量约34万吨。
啤酒：1900年我国最早的啤酒厂于哈尔滨建成。
2001年产量达到2200万吨左右。
步入新世纪后，形成了青啤、燕京、华润“三强”鼎立。
在医药方面，抗生素得到迅猛发展，1998年抗生素产量达到33486 t，其中青霉素的产量居世界首位。
其他生化药物中，初步形成产业化规模的有干扰素、白细胞介素、乙型肝炎疫苗等。
在农药方面，生物农药品种达85种，主要有苏云金芽孢杆菌、井冈霉素、赤霉素等。
其中井冈霉素的产量居世界首位。
在食品与饲料方面，作为三大发酵制品的味精、柠檬酸、酶制剂的产量也有很大增加，如味精产量万吨增加到万吨，其生产和消费居世界第一；还有柠檬素的生产和出口也居世界第一。
在保健品方面，中国已能生产多种氨基酸、核酸、维生素等。
但是，也存在诸多问题。
中国发酵水平与国际先进水平的差距：①多数工厂规模小、效益低；②生产技术水平比较低；③产品品种单一，结构不合理；④应用的深度和广度不够；⑤技术装备和检测手段落后，自动化水平低；⑥综合利用和环境治理差。
3、发酵工程的发展前景①基因工程的发展为发酵工程带来新的活力。
②新型发酵设备的研制为发酵工程提供先进工具。
③大型化、连续化、自动化控制技术的应用为发酵工程的发展拓展了新空间。
④生态型发酵工业的兴起开拓了发酵的新领域。
⑤再生资源的利用给人们带来了希望。
本课程的教学目的和内容1、本课程的教学目的2、教学内容第一章绪论(4学时) 第二章菌种的来源(4学时) 第三章发酵培养基(4学时) 第四章发酵工业的无菌技术(4学时)第五章种子的扩大培养(4学时) 第六章抗生素发酵生产工艺(2学时) 第七章啤酒发酵生产工艺(4学时) 第八章氨基酸发酵生产工艺(2学时) 第九章发酵过程控制(12学时) 第二章菌种的来源教学目的：了解工业化菌种的要求以及一些工业化生产菌介绍；了解菌种分离的一般过程；掌握土样采集应注意的问题，菌种的分离方法；掌握优良菌种应具备的基本特性和菌种的选育。
教学重点、难点：土样采集应注意不同的土壤特点、地理和气候条件，土样的采集方法；生化反应分离法；第 3 页长江大学生科院生物技术系《发酵工程》讲义诱变育种。
第一节工业化菌种的要求及已工业化产品生产菌介绍一、工业化菌种的要求? ? ? ? 能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物；遗传性能要相对稳定；菌种改造的可操作性要强；抗噬菌体及杂菌污染能力强；? 产生菌及其产物的毒性必须考虑；● 发酵条件如温度、pH、溶解氧等易控制。
二、已工业化产品生产菌介绍1、抗生素生产有关的微生物2、氨基酸生产有关的微生物50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点。
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
3、食品酶制剂生产有关的微生物利用微生物来进行酶制剂生产是19世纪日本人用曲霉通过固体培养生产他卡淀粉酶，而大规模工业化生产则始于20世纪40年代末日本用深层发酵法生产α—淀粉酶。
第二节自然界中目的微生物的分离一、菌种分离的一般过程标本采集→ 预处理→ 富集培养→ 菌种分离→ 性能鉴定→ 菌种保藏二、微生物材料的标本采集一般通过以下途径获得菌种：①向菌种保藏机构索取有关菌株；②自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等；③从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌。
自然界中微生物极其丰富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤样品往往是采集的首选目标。
土样采集应注意以下问题：A、不同的土壤特点因土壤组成、有机物浓度、pH等条件的不同，微生物的种群分布会非常不同。
如菜园和农田常以细菌和放线菌较多；果园树根土壤中酵母菌含量较高；动植物残骸及腐殖土中霉菌较多；根瘤菌多在豆科植物根系土壤中分离；分解石油的微生物常在油田和石油炼油厂附近的土层中分布最多。
B、地理和气候条件南方和北方，一年四季。
许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方。
秋季采土样最为理想。
采土样的方法：南方，用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。
北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。
给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
C、微生物的生理特性Ｄ、极端环境条件下采样分离极端微生物的采集。
第 4 页长江大学生科院生物技术系《发酵工程》讲义三、标本的预处理提高菌种分离的效率。
表2-2 四、目的微生物富集的一些基本方法? 富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
