热诱导表达的水稻OsBBX30基因克隆和表达分析

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水稻抗旱基因克隆与功能分析

水稻抗旱基因克隆与功能分析水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是全球人口最多的食物来源之一。

然而，气候变化和人类活动对水稻生长环境的影响使得旱灾成为水稻生产的一个主要问题。

为了解决这个问题，诸多科学家和研究者们致力于水稻抗旱相关基因的克隆和功能分析。

本文将就此主题进行深入探讨。

一、水稻抗旱基因的克隆基因克隆是研究生物学领域中最为基础的工作之一。

对于水稻抗旱相关基因，研究者们主要采用了几种方法进行克隆：1. 定向克隆方法定向克隆方法利用已知的水稻基因序列，设计引物并通过PCR扩增得到目的基因。

这种方法通常需要先进行序列分析，以确定检测到的基因是否确实与抗旱有关。

2. 突变法突变法是一种重要的工具，在基因识别中也有着广泛的应用。

通过一种方法制造突变体，通常是突变基因的一部分进行替换，然后筛选出表现与正常个体不同的后代，以此来确定与抗旱相关的部分。

这种方法已经被证明是相当有效的，已经被成功的应用于水稻抗旱基因的克隆中。

3. 比较基因组学比较基因组学是另一种克隆方法。

这种方法通过比较已知基因组里的两个或多个不同物种的基因组序列，以发现相同或相关的DNA序列。

这些DNA序列被认为可能控制抗旱程度，因此是在水稻远缘物种中寻找抗旱基因的最重要的方法之一。

二、水稻抗旱基因的功能分析水稻抗旱基因的克隆帮助了我们确定了哪些区域与抗旱有关。

接下来的任务是进行功能分析，以进一步了解基因如何工作，从而指导作物育种。

1. 基因转录与表达分析在确定与抗旱相关的基因后，下一步是通过转录分析研究其表达模式。

实验方法可以采用RT-qPCR和Northern blots等。

2. 基因诱导逆境试验基因诱导逆境试验是一种通过农艺手段给水稻植株施加不同的逆境处理来模拟自然环境的方法。

通过人为加压或人造干旱的处理，可以更好的研究与抗旱相关的基因的作用。

3. 基因敲除技术基因敲除技术是通过人为干扰特定基因的表达，来分析某一基因在水稻生长时是否影响其抗旱性的技术。

水稻OsOr基因的克隆及其功能研究

ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｈａｄｂｅｅｎｄｏｎｅｂｙｓｏｍｅｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｓｈｏｗｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ：（１）ＴｈｅｂｌａｓｔｒｅｓｕｌｔｏｆｔｗｏＯｓＯｒｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，ｔｈｅｒｅｗａｓｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
其次，我们对水稻两种ＯｓＯｒ蛋白进行了序列比对，并选取ＯｓＯｒｌ用来构建Ａｃｔｉｎ：：ＯｓＯｒ：：ｏｃｓ表达载体。重组质粒Ａｃｔｉｎ：：ＯｓＯｒ：：ｏｃｓ经测序限制性内切酶酶切验证正确后，通过农杆菌介导的转基因方法转入野生型水稻日本晴，使该基因得到过量表达，并对转基因水稻进行分子鉴定以及表型分析。主要结论如下：
ｓｕｃｃｅｓｆｕｌｌｙａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎａｈｉｇｈｅｒｌｅｖｅｌ，ａｎｄｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｈａｐｐｅｎｅｄ．
ＩＶ
（４）Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＨＰＬＣｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈｅｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔｖａｒｉｆｉｅｄｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｄｕｒｉｎｇｒｉｃｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄｔｈｅＯｓＯｒｄｅｌａｙｅｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ
ｎｏｎ—ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｑｕｅｎｃｈｉｎｇｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｎｅｏｘａｎｔｈｉｎｓｙｎｔｈａｓｅｐｈｙｔｏｅｎｅｄｅｓａｔｕｒａｓｅｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍｐｈｙｔｏｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ
ｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏＰＴＣ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｔｒｉｃｔｄｏｕｂｌｅ—ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｒｅｓｕｌｔＷａｓｃｏｒｒｅｃｔ．

水稻OsNAD的克隆预测及逆境下的表达分析

分子植物育种，2011年，第9卷，第6期，第680－687页Molecular Plant Breeding,2011,Vol.9,No.6,680－687研究报告A Letter水稻OsNAD-ME1的克隆、预测及逆境下的表达分析周滈杨传平*柳参奎*林木遗传育种与生物技术国家重点实验室,盐碱地生物资源环境研究中心,东北林业大学,哈尔滨,150040*通讯作者,yangcp@;shenkuiliu@摘要植物中的苹果酸酶能够参与光合作用、呼吸作用和脂类生成等多种重要的代谢途径，而且与植物的逆境防御有着密切的关系。

为研究水稻中一个苹果酸酶基因(OsNAD-ME1,Gene ID:4343294)的基本特征及其与逆境间的响应关系，克隆得到该基因的cDNA片段，应用生物信息学对其序列进行分析及预测，并运用Northern检测的方法，对该基因在多种非生物逆境下的表达情况做出研究。

由序列分析结果可知，OsNAD-ME1的ORF为1869bp，编码622个氨基酸，Os NAD-ME1属于植物NAD-ME的α亚组，其理论分子量为68.9kD，理论等电点为6.03。

预测结果表明该蛋白属于苹果酸酶家族，无跨膜结构域，定位于线粒体上。

并利用GFP定位的方法，在拟南芥悬浮细胞中对亚细胞定位的预测结果进行了验证。

Northern检测结果显示，OsNAD-ME1能够响应多种非生物逆境，在NaCl和NaHCO3胁迫下其表达水平在24h时达到最大，在PEG和H2O2胁迫下其表达水平在12h时达到最大。

该结果表明OsNAD-ME1可能与植物对非生物胁迫的响应有关。

关键词OsNAD-ME1,序列分析,亚细胞定位,Northern检测Cloning and Prediction of OsNAD-ME1from Oryza sativa L.and Its Expression Profiles under StressesZhou Hao Yang Chuanping*Liu Shenkui*State Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology,Alkali Soil Natural Environmental Science Center(ASNESC),Northeast Forestry University,Harbin,150040*Corresponding authors,yangcp@;shenkuiliu@DOI:10.3969/mpb.009.000680Abstract Malic enzymes in plants are involved in diverse important metabolic pathways,such as photosynthesis, respiration and lipid biosynthesis.And it was found that malic enzymes were involved in plant defense responses. In order to investigate the characters of a rice malic enzyme gene(OsNAD-ME1,Gene ID:4343294)and confirm the response relationship between this gene and stress environments,OsNAD-ME1was cloned and bioinformatics analysis and northern analysis of the response to stress environments about this gene were performed.The results of sequence analysis indicated that the open reading frame of OsNAD-ME1was1869bp in length,encoding622 amino acid residues.Os NAD-ME1belonged toαgroup of plant NAD-ME with predicted molecular weight of 68.9kD and isoelectric point of6.03.Os NAD-ME1was a member of malic enzyme family,whereas it didn't have transmembrane domain.Sub-cellular location prediction showed that Os NAD-ME1was located in mitochondria, and the predicting result was verified in Arabidopsis protoplasts using green fluorescence protein to track the location of this protein.The results of northern analysis indicated that OsNAD-ME1had response to several abiotic stresses.In the presence of NaCl and NaHCO3,transcripts of OsNAD-ME1reached peak level at24h of treatment, and the expression of OsNAD-ME1was induced drastically at12h under PEG and H2O2stresses.The results indicated that OsNAD-ME1was involved in response to abiotic stresses.Keywords OsNAD-ME1,Sequence analysis,Sub-cellular location,Northern detecting苹果酸酶(Malic enzyme)广泛存在于动物、植物及微生物中，它能在二价金属离子存在的条件下，与氧化型辅酶NAD(P)+结合，催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸盐和二氧化碳，在此过程中NAD(P)+还原分子植物育种Molecular Plant Breeding为NAD(P)H(Chang and Tong,2003)。

水稻OsBTB蛋白在非亲和亲和互作中的表达模式初探

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2006,14(6):911~916*基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.30471176）资助。

作者简介：姜玉新（1971~），男，博士研究生。

E-mail ：<jyxin@>.**通讯作者。

Author for correspondence 。

教授，博士生导师，主要从事植物病理与分子生物学。

E-mail ：<lidb@.>.收稿日期：2006-03-16接受日期：2006-04-08·研究论文·水稻OsBTB 蛋白在非亲和/亲和互作中表达方式的初步研究*姜玉新，李德葆**(浙江大学生物技术研究所，杭州310029)摘要：为了解水稻OsBTB 蛋白在非亲和/亲和互作中的表达情况，构建含全长基因的原核表达载体，经诱导表达及纯化获得OsBTB 蛋白。

以OsBTB 蛋白为抗原制备兔多克隆抗体，经间接ELISA 法测定抗体效价为1∶2000。

Western blot 分析确认该抗体与OsBTB 蛋白可以特异结合。

应用该抗体检测受不同稻瘟病菌(生理小种侵染的相应水稻(品系中OsBTB 蛋白的表达，结果表明OsBTB 蛋白的表达方式呈多样性，该蛋白在非亲和反应中的表达时间明显早于其在亲和反应中的表达。

免疫胶体金技术确认OsBTB 蛋白存在于细胞核内。

关键词：OsBTB 蛋白；多克隆抗体；非亲和/亲和互作；细胞学定位中图分类号：S188，S435.111；文献标识码：A ；文章编号：1006-1304（2006）06-0911-06A Preliminary Investigation on the Expression of Rice OsBTB Protein in theIncompatible/Compatible Interactions between Rice andJIANG Yu-xin,LI De-bao**To understand the expression of rice OsBTB protein in the incompatible/compatible interactions between rice and ,recombinant prokaryotic expression vector containing full-length sequence of open reading frame fromgenewas constructed.Polyclonal anti-OsBTB rabbit antibody has been successfully prepared by using purified OsBTB protein as immuno-gen.The titer of antiserum against OsBTB was about 1:2000using ELISA.Western blotting analysis showed that the antiserum could be binded to the expression OsBTB protein specifically.The OsBTB expression pattern in different rice (lines inducedby correspondingisolates displayed diversities when detected by using anti-OsBTB antiserum.OsBTB proteinwas expressed earlier noticeably in incompatible interaction than that of compatible.Immuno-gold labeling test was performed,and it was found that the protein localized in the nuclei ofinfected ricecellsOsBTB protein;polyclonal antibody;incompatible/compatible interaction;cellular localizationBTB/POZ (BR-C,ttk and bab (Zollman,1994)or Pox virus and Zinc finger (Aravind and Koonin,1999))蛋白结构域位于C 2H 2类锌指转录因子的N 末端区域，含该结构域的家族蛋白多定位于细胞核(Cao.,1997;Sakai ,2000;Woodger 2004)。

水稻渗透胁迫抑制表达基因的克隆与表达分析

水稻渗透胁迫抑制表达基因的克隆与表达分析摘要通过基因芯片技术，鉴定了一个PEG6000胁迫抑制表达基因。

该基因编码MYB转录因子，命名为OsSRMYB1。

荧光定量PCR研究结果表明，该基因的表达显著受PEG6000抑制，受氧化胁迫诱导，而低温和ABA处理下该基因的表达未发生显著变化。

组织表达分析结果表明，OsSRMYB1基因在水稻不同组织中均有表达，在叶中表达量较高。

在不同生长阶段的穗中，OsSRMYB1基因在发育中的穗中表达较高，在成熟穗和幼穗中表达量较低。

本研究为进一步深入分析OsSRMYB1的生物学功能提供参考。

AbstractA gene encoding MYB transcription factor was identified as a PEG6000-repressive gene by microarray，designated OsSRMYB1.Real-time RT-PCR assay suggested that expression of OsSRMYB1 was significantly repressed by PEG6000，while not markedly changed upon ABA or cold stress. OsSRMYB1 expression existed in the different tissues of rice and the expression was the highest in leaves. The tissue-specific expression of OsSRMYB1 indicated that it was highly expressed in the developing panicles. This study provide reference for the depth analysis of the biological functional of OsSRMYB1.Key wordsMYB；rice；osmotic stress；panicle development；transcription factor植物对非生物胁迫的适应依赖于一系列信号级联反应的激活，包括胁迫信号的感知、信号转导、胁迫相关基因的表达及胁迫相关代谢物的积累，从而对损伤进行修复，进而对细胞的稳态进行重建。

水稻苗期低温诱导表达新基因OsCOI的克隆、过表达载体的构建与转化

水稻苗期低温诱导表达新基因OsCOI的克隆、过表达载体的构建与转化孙琦1,2,刘香玲2,张宁1,余柏胜2【摘要】摘要：水稻苗期冷害是导致水稻减产的重要因素之一。

为了发掘新的耐冷基因、诠释其耐冷分子机制并应用分子育种的手段提高水稻苗期耐冷性，前期已通过Northern表达分析，从已构建的水稻苗期低温诱导表达正向抑制差减cDNA文库中，发现了一个受低温诱导上调表达的功能未知的C2H2型锌指结构域蛋白新基因(特命名为OsCOI)。

本研究进一步通过RT-PCR的方法从水稻中克隆了该基因，构建了其植物过表达载体,并通过农杆菌介导转入水稻基因组中，获得了其过表达转基因水稻株系，为进一步研究该基因的功能并探讨其在水稻耐冷分子育种中的应用价值奠定了基础。

【期刊名称】华北农学报【年(卷),期】2010(025)001【总页数】5【关键词】水稻;低温诱导表达基因;载体构建；遗传转化基金项目：国家自然科学基金项目(30871333)水稻是世界上重要的粮食作物之一，也是生物学研究较理想的模式植物。

苗期冷害是水稻低温冷害的常见类型。

水稻苗期受到15℃以下的低温危害后，即导致秧苗失绿、发僵、分蘖减少，甚至枯萎、死苗等[1]。

这种冷害在我国长江中下游的早稻种植区和东北、西北稻区及云贵高原的一季稻区常有发生，由此导致的烂秧现象是这些地区水稻减产的主要因素之一[2],也是世界水稻生产上经常遇到的普遍问题[3]。

选育耐冷性水稻品种是解决苗期低温冷害问题最经济有效的措施。

经典遗传学的研究表明,水稻苗期耐冷性是受多基因控制的数量性状[4]。

随着水稻DNA分子标记的发展以及高密度分子遗传图谱的建立，利用QTL分析技术，已有研究者利用不同的定位群体对水稻苗期耐冷性进行了QTL分析[5-7]，表明水稻苗期耐冷性具有较广泛的遗传多样性，控制水稻苗期耐冷性的多基因位点在水稻基因组中可能呈分散分布。

随着分子生物学技术的发展、水稻全基因组测序工作的完成，水稻中一些苗期耐冷相关基因的克隆也相继有所报道[8-11]。

《水稻OsGH3-4生物学功能分析》范文

《水稻OsGH3-4生物学功能分析》篇一一、引言近年来，植物生长素应答的调控研究成为生物学领域的热点，其中生长素相关基因作为调节植物生长与发育的重要基因组之一，受到广泛的关注。

OsGH3-4是一种生长素相关基因，其在水稻（Oryza sativa）中的表达和功能研究具有重要的科学意义。

本文旨在分析水稻OsGH3-4的生物学功能，以期为农业生产及植物生长发育研究提供理论基础。

二、材料与方法1. 材料本研究采用的水稻品种为粳稻（Nipponbare），以及经由分子生物学技术构建的OsGH3-4基因的过表达和抑制表达转基因株系。

2. 方法（1）基因克隆与转基因株系构建：通过PCR技术克隆OsGH3-4基因，并构建过表达和抑制表达的转基因株系。

（2）表达分析：利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，分析OsGH3-4基因在不同组织及不同发育阶段的表达情况。

（3）表型分析：对转基因株系进行表型观察，分析OsGH3-4基因过表达或抑制表达对水稻生长发育的影响。

（4）功能分析：利用酵母双杂交、生物化学实验及分子生物学技术，探讨OsGH3-4的生物学功能及其与生长素等植物激素的关系。

三、结果与分析1. 基因表达分析通过qRT-PCR实验发现，OsGH3-4基因在水稻不同组织及不同发育阶段存在差异性表达。

在根、茎、叶等组织中均有一定程度的表达，而在分蘖期、抽穗期和成熟期等生长发育阶段，其表达量有明显变化。

2. 表型分析（1）过表达株系表型分析：OsGH3-4基因过表达的转基因株系表现出较强的生长势和分蘖能力，株高和生物量显著增加。

同时，对病虫害的抗性也得到了一定程度的提高。

（2）抑制表达株系表型分析：与野生型相比，OsGH3-4基因抑制表达的转基因株系生长势较弱，分蘖能力降低，株高和生物量明显减少。

此外，这些株系对某些病虫害的抗性也较弱。

3. 功能分析（1）酵母双杂交实验：通过酵母双杂交实验发现，OsGH3-4可以与其他生长素相关蛋白发生相互作用，表明其可能参与生长素的信号传导过程。

受水稻纹枯病菌诱导表达OsWRKY基因的克隆及初步分析的开题报告

受水稻纹枯病菌诱导表达OsWRKY基因的克隆及初步分析的开题报告该文的开题报告如下：论文题目：受水稻纹枯病菌诱导表达OsWRKY基因的克隆及初步分析研究背景：水稻纹枯病是世界性水稻病害之一，能够对水稻产生严重威胁。

病原菌通过感染水稻，引发水稻免疫反应，并激活了多种抗病基因的表达，其中WRKY基因家族是受到广泛关注的一类。

为了更好地理解WRKY基因家族在水稻病害免疫反应中的功能，本研究致力于克隆水稻纹枯病中的OsWRKY基因，并进行初步的表达分析。

研究内容：1. 通过基因克隆技术从病原菌中克隆纹枯病相关OsWRKY基因。

2. 利用生物信息学方法，对OsWRKY基因序列进行分析，并进行序列比对、生理学性质分析和亚细胞定位预测等操作。

3. 我们将通过qRT-PCR实时荧光定量PCR技术，来分析OsWRKY基因在水稻感染纹枯病菌后的表达变化情况。

研究意义：该研究的结果有助于深入了解OsWRKY基因家族在水稻病害防御中的作用，为研究水稻的免疫反应机制提供新的理论基础和实验依据，并为水稻病害的防治提供先导性的信息。

研究方法：该研究将采用基因克隆技术、生物信息学分析、qRT-PCR实时荧光定量PCR技术等多种实验手段来完成相关研究。

预期结果：本研究预计成功克隆水稻纹枯病中的OsWRKY基因，并针对其生物学性质、表达变化等方面进行分析和研究。

研究难点：本研究中的主要难点在于基因的克隆和成功表达，以及在水稻纹枯病感染后进行基因表达研究的操作难度。

研究进度：本研究已经完成了基因克隆和生物信息学分析的预实验操作，并正在准备实验室实验操作的具体方案，预计在接下来的几个月内开始实验操作。

水稻OsbolA1基因克隆与表达研究的开题报告

水稻OsbolA1基因克隆与表达研究的开题报告1. 研究背景与意义水稻 (Oryza sativa L.) 是人类重要的粮食作物之一，为满足世界人口不断增长的需求，提高水稻产量是当今农业面临的重大挑战。

OsBolA1 基因已被证实与水稻开花时间和产量密切相关。

该基因是水稻中一个新的成员，属于膜结合蛋白家族，在水稻成长过程中起着重要的调控作用。

因此，对 OsBolA1 基因进行克隆与表达研究，有助于揭示其在水稻生长发育过程中的具体作用机制，为水稻的培育及品种改良提供依据和基础。

2. 研究内容与方法(1) OsBolA1 基因克隆从水稻基因库中，利用PCR技术克隆得到OsBolA1 基因序列，并进行测序验证。

(2) OsBolA1 基因表达利用相关的蛋白质表达向量，将克隆得到的 OsBolA1 基因插入到表达载体中，将其转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达。

采用 SDS-PAGE 和 Western blotting 鉴定重组蛋白的表达及纯化情况。

(3) OsBolA1 基因功能研究利用获得的重组蛋白，进一步开展亲和层析、GST Pull-down 和免疫共沉淀等技术，探究 OsBolA1 基因的功能及作用机制。

3. 预期研究结果通过本次研究，预计可完成 OsBolA1 基因的成功克隆、表达和纯化，进一步探明该基因在水稻生长发育中的作用机理，为水稻产量提高和品种的改良提供理论基础和技术支撑。

4. 研究难点和创新点(1) 难点：OsBolA1 基因在水稻中作用机制尚不清楚，因此需要设计适当的实验方案，以确定其功能及调控机制。

(2) 创新点：通过揭示 OsBolA1 基因在水稻中的作用机制，为水稻产量提高和品种改良提供了更解决方案，并为其它作物的遗传改良提供了新的研究思路。

《水稻突变体库创制及OsARP基因功能的初步研究》

《水稻突变体库创制及OsARP基因功能的初步研究》一、引言水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，其产量和品质对保障全球粮食安全具有举足轻重的地位。

随着分子生物学和遗传学技术的飞速发展，通过基因编辑和突变体库的创建来研究水稻的遗传特性和功能基因已成为现代农业生物技术的重要方向。

本研究旨在创制水稻突变体库，并对其中的OsARP基因功能进行初步研究，以期为水稻的遗传改良和品种优化提供理论依据。

二、水稻突变体库的创制1. 材料与方法本实验选用高产优质的水稻品种作为亲本，利用化学诱变剂和物理诱变源进行诱变处理，通过单株选择和自交纯化，最终获得大量的突变体材料。

2. 突变体库的构建经过多代自交纯化后，我们成功构建了一个包含数千个突变体的水稻突变体库。

通过表型观察和遗传分析，筛选出具有明显农艺性状改变的突变体，为后续的基因功能研究奠定基础。

三、OsARP基因的初步功能研究1. 基因克隆与序列分析从突变体库中筛选出与农艺性状相关的突变体，通过基因组测序和生物信息学分析，成功克隆了OsARP基因，并对其序列进行了详细分析。

2. 基因表达模式研究利用实时荧光定量PCR技术，我们研究了OsARP基因在不同组织、不同发育阶段的表达模式，初步揭示了其表达规律与水稻生长发育的关系。

3. 基因功能验证通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，我们在野生型水稻中敲除了OsARP基因，观察到了明显的表型变化。

同时，我们还利用过表达转基因技术，在转基因水稻中过表达OsARP基因，分析了其对水稻生长和产量的影响。

这些实验结果为进一步验证OsARP基因的功能提供了有力证据。

四、结果与讨论1. 突变体库的创制成功为我们提供了丰富的遗传资源，有助于我们深入研究水稻的遗传特性和功能基因。

2. 通过对OsARP基因的初步功能研究，我们发现该基因在水稻生长发育过程中具有重要作用。

敲除OsARP基因会导致植株表型发生明显改变，而过表达该基因则能提高水稻的生长速度和产量。

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热诱导表达的水稻OsBBX30基因克隆和表达分析作者：饶力群等来源：《湖南大学学报·自然科学版》2015年第06期摘要：生物信息学分析表明：OsBBX30基因启动子含有与逆境相关的作用元件HSE.为进一步了解OsBBX30基因在生物体内受热诱导，通过OsBBX30基因克隆构建原核表达和实时定量PCR分析，证实OsBBX30基因表达受热胁迫诱导，能增强大肠杆菌的耐热能力，为深入了解该家族基因和挖掘水稻耐热基因奠定基础.关键词：克隆；水稻BBX基因；热胁迫；实时定量PCR中图分类号：S511 文献标识码：AAbstract：Bioinformatics analysis indicates that the promoter of OsBBX30 contains function element HSE， which is related with adversity. In this study， it is found that OsBBX30 gene expression is induced by heat stress， which enhances the E. coli heat resistant ability through bioinformatics，Gene clone prokaryotic expression and realtime quantitative PCR analysis. The results are helpful in understanding the family genes and rice heat resistant genes.Key words：clone； OsBBX； heat stress； QPCR水稻是我国重要粮食作物，高温是制约水稻生产和产量的重要因素，培育耐热水稻品种是保证水稻稳产的重要手段[1]，而利用基因工程技术是获得水稻耐热新品种的重要途径[1]，因此筛选和克隆水稻耐热相关的基因受到人们关注.锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，在基因表达、细胞分化、胚胎发育、增强抗逆性等方面具有重要的调控作用[2]，对植物的生物发育和胁迫的响应是至关重要的[3]，在光调节植物生长发育中也是不可替代的[4-5].BBX是一类含有Bbox结构域的锌指蛋白，通过生物信息学分析发现，在水稻中有30个BBX基因，拟南芥中有32个BBX基因[6-8].其中Bbox 家族中有一类只在N端具有多个Bbox结构域，在C端不具有CCT结构的锌指蛋白，称为DBB （Double Bbox）蛋白亚族基因.拟南芥DBB亚家族中有8个编码基因，通过比对发现水稻中有10个OsDBB同源基因[6].拟南芥中该亚家族基因参与调控拟南芥光形态建成、光周期调控开花时间，花的发育、耐热，而在水稻中关于该亚家族基因的功能还未有报道[7].本研究对OsDBB亚家族中的OsBBX30进行耐热相关的生物信息学分析和运用实时定量PCR技术检测其在不同水稻品种中响应热胁迫的表达特征，并通过构建含OsBBX30蛋白的大肠杆菌菌株和分析其对大肠杆菌耐热能力的影响，明确OsBBX30基因响应热胁迫的表达特征，为深入了解其在生物响应热胁迫信号途径中的作用奠定基础.1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1材料水稻材料为国家杂交水稻中心提供的水稻品种日本晴（ Oryz asativa L ssp.），9311，N22，种植于湖南农业大学人工气候室，水稻生长至幼穗分化期（6期末7期初），分别以0 h，3 h，6 h和12 h在42 ℃进行热处理.1.1.2菌株、质粒与试剂大肠杆菌菌株DH5αpGEMT vector，Taq酶和Marker 以及DNA快速纯化回收试剂盒，购于天根生化材料（北京）有限公司，质粒PET30a由本实验室保存所得，DNA限制性内切酶，反转录试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）购于长沙海洋生物技术有限公司（Fermentas公司代理）， RNA Simple Total RNA Kit购于北京天根生化科技有限公司，荧光定量PCR试剂盒[UltraSYBR Mixture（with ROX）]购于康为世纪.1.2方法1.2.1生物信息学网站介绍RMAP（http：///index.jsp）——a newgeneration rice genome browser，即RMAP数据库，该数据库收录了全稻属基因组图谱，且从该网站中可以查找目的基因的全长基因组序列、CDS以及潜在的启动子序列.PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）——Cis-Acting Regulatory Element，植物顺式作用元件数据库，从该网站中可以分析植物中已知基因的启动子区含有的顺式作用元件.String （http：///）——functional protein association networks，蛋白相互作用数据库，通过已知的蛋白序列查找同源蛋白和相互作用分析.1.2.2生物信息学分析通过NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）网站搜寻到其核酸序列，再利用Rice-map （http：///index.jsp）对水稻OsBBX30基因的结构特征进行分析，并对其启动子区域在PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站上进行顺式作用元件分析.通过String （http：///）网站进行蛋白同源性和相互作用分析，最后在ROAD （http：///index.shtml）网站对水稻OsBBX30基因进行基因生物芯片分析.1.2.3载体克隆采用天根生化科技（北京）有限公司RNA提取试剂盒的方法提取水稻日本晴叶片的RNA.利用GenBank中水稻基因组序列获得OsBBX30基因的CDS序列，并利用Primer Premier5.0设计特异的克隆引物：F（5′to3′）： TCCTTGTAGTCCCGCGGATGAGGATCCAGTGCGACG，R（5′to3′）： AGGATCCCGGGTACCTCATCCAAGATCAGAACG AT在正向引物和反向引物的5'分别引入EcoRI 和HindIII酶切位点.50 μL的反应体系为：1 μL EasyTaq；5 μL 10*buffer；前后引物各1 μL；5 μL cDNA；33 μL ddH2O；4 μL dNTP；PCR反应体系为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；最后72 ℃延伸5 min.PCR 产物用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳进行检测.利用DNA纯化试剂盒切胶回收目的片段，将目的片段与T载体链接，通过热激法将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中.37 ℃过夜培养后，挑取单菌落进行PCR，并提取阳性克隆的重组质粒进行酶切验证.阳性克隆由铂尚生物技术有限公司测序.将目的片段从T载体上经EcoRI 和HindIII切下回收后，与用内切酶EcoRI 和HindIII酶切纯化后的PET30a载体，去磷酸化后进行连接，用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经验证为重组的表达载体.1.2.4大肠杆菌耐热性分析融合蛋白诱导表达：先挑BL21/30aOsBBX301，2，3单克隆于5 mL LB培养基中，37 ℃震荡培养至OD600=0.6～0.8，然后加6 μL IPTG，23 ℃震荡培养过夜，离心收集菌体备用.SDSPAGE检测：配置凝胶质量分数为12.6%的分离胶，在烧杯中依次加入下列试剂：30%丙烯酰胺1.5 mL，pH 8.8，1 mol/L TrisHCl 1.2 5 mL，蒸馏水7.05 mL，10%SDS 100 μL，10%过硫酸100 μL，TEMED 10 μL.将所收集菌体用PBS磷酸缓冲液重悬，超声波破碎10 min后离心弃上清，加10 μL loading buffer充分混匀后沸水浴10 min，冷却后上样.分别挑BL21/pET30a，BL21/30aOsBBX30单克隆于5 mL LB培养基中，37 ℃震荡培养至OD600=0.6～0.8；加6 μL IPTG，23 ℃震荡培养过夜；将培养物置于50 ℃下分别震荡培养0 h，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h和3 h；将菌液稀释100倍后涂布于LB平板，37 ℃倒置培养过夜；拍照、计数.1.2.5OsBBX30基因表达水平的定量PCR（qRTPCR）验证水稻幼穗分化至6～7期的整片剑叶进行了42 ℃高温热处理0 h，3 h ，6 h，12 h后利用QPCR对OsBBX30基因表达水平进行了验证.首先，利用Primer Premier 5.0设计序列特异的QPCR引物（表1），actin为内参基因.采用Trizol 法抽提水稻叶片总RNA，利用反转录试剂盒转录成cDNA，再利用UltraSYBR Mixture（with ROX）试剂盒配制20 μL体系：13.2 μL ddH2O，5 μL mix，前后引物各0.4 μL，1 μLcDNA.在ABI7300上进行qRTPCR反应，反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 32 s，40个循环.通过溶解曲线来确定QPCR反应的特异性.再利用相对定量（2-△△Ct）[8]分析目标基因表达水平的变化[9].2结果与分析2.1芯片数据分析2.1.1启动子作用元件分析通过RMAP软件分析表明水稻基因OsBBX30（LOC_Os12g10660）位于12号染色体中，长度为2537 bp，通过将其启动子序列放入PLANTCARE里面进行启动子元件分析.发现除了含有多个 TATABox 和 CAATBox 等基本转录元件外，还有多个与逆境相关的元件.其中高温响应元件有HSE，circadian，Gbox，Skn1_motif，ACE，干旱低温响应元件有 MBS，ARE元件.此外，还含有大量与光响应的元件，如 GAmotif，chsCMA1a，ERE，MRE 等.2.1.2OsBBX30蛋白同源性分析通过NCBI搜索到OsBBX30的蛋白序列，将其蛋白序列放入STRING网站搜索结果发现LOC_Os12g10660在粳稻中发现的同源性较高的蛋白都为DBB亚家族中的蛋白.在其他物种如水稻籼稻，二穗短柄草，高粱，葡萄，拟南芥，苔藓，毛果杨这7种（见表2）也发现同源性较高的蛋白.同时也发现了10种与OsBBX30蛋白功能协作的蛋白质，其中相互作用最强的3种蛋白质都来自粳稻品种（表3）.2.1.3水稻芯片分析因为OsBBX30基因中含有HSE元件，因此将其在ROAD网站中进行了分析.在OsBBX30基因响应热胁迫中，结果表明（图1（a））OsBBX30基因的2个探针在根部的表达量都较高，经过 42 ℃的热胁迫处理，该基因的表达量升高很多，表明该基因对热胁迫逆境有正响应作用.图1（b）结果则表明OsBBX30基因的2个探针在籼稻干旱胁迫敏感型和籼稻干旱胁迫耐受型中其表达量都很低.经过干旱胁迫后，其表达量上调明显，表明该基因在同种材料不同类型中对干旱胁迫起到相同的正调控作用.2.2原核表达载体构建为进一步研究水稻OsBBX30基因的功能，本实验构建了一个原核表达载体PET30a，用于体外表达OsBBX锌指蛋白.以水稻基因组cDNA为模板，PCR扩增得到目的片段（图2（a））.将该目的片段进行纯化回收链接到pGEMT上，并转化至大肠杆菌DH5α中，获得带有目的片段的重组载体.将获得的重组载体的阳性菌落进行扩大培养，提取质粒.经过HindⅢ与EcoRⅠ酶切，胶回收，去磷酸化，连接，转化4个步骤将目的片段连接到PET-30a上，获得重组载体（图2（b））.2.3大肠杆菌耐热性分析将构建好的30aOsBBX30载体转化大肠杆菌BL21，确定诱导条件后批量摇菌，超声波破碎后离心收集沉淀，加样品稀释液后点样.在电压150 V下电泳1 h，电泳图见图3，图中Ⅰ为空载未经IPTG诱导；Ⅱ为空载经IPTG诱导；Ⅲ为30aOsBBX30未经IPTG诱导：Ⅳ为30aOsBBX30经IPTG诱导.由图3中可发现，与负对照相比在14～20 KD处出现一条额外条带，即OsBBX30与His Tag的融合蛋白.生物信息学分析表明OsBBX30含有HSE顺式作用元件，受高温诱导.本实验对转入了OsBBX30的大肠杆菌菌株进行了耐热性分析，热处理温度为50 ℃，并以含pET30a空载体的大肠杆菌做负对照，通过MTT法测定大肠杆菌活数[10]，结果发现含OsBBX30的转基因大肠杆菌的存活率较含pET30a空载体的大肠杆菌有明显提高.说明OsBBX30融合蛋白可能与细菌耐热相关蛋白相互作用，使其对热胁迫的耐受有所提高（图4）.融合蛋白SDSPAGE检测2.4水稻热胁迫分析为了证实OsBBX30基因在水稻中受热胁迫诱导，笔者选用日本晴，9311，N22，3种水稻品种在0 h，3 h，6 h，12 h进行42 ℃热处理，以0 h处理作为对照组，采用荧光定量PCR检测OsBBX30基因的表达水平，结果表明（图5），在不同的水稻品种中，OsBBX30基因表达各异.日本晴品种中OsBBX30基因表达量较低，在12 h处理后，OsBBX30基因的相对表达量又有所增加.9311品种中OsBBX30基因表达量也低，并且其相对表达量降低，而N22品种中，OsBBX30基因表达呈明显增加，且随热处理时间延长，其相对表达量呈现明显增加趋势.日本晴为粳稻常规水稻，9311为籼稻常规水稻，N22为籼稻耐高温品种.在上述结果我们证明了，OsBBX30基因在N22中经过热处理后，影响其表达量，推测OsBBX30为耐热基因.3结论通过PLANTCARE分析发现，OsBBX30的启动子区域含有多个的逆境响应顺式作用元件，如HSE，Gbox和ABREs等，结合芯片分析结果发现OsBBX30的表达受高温诱导.通过实时定量PCR验证发现该基因在耐热水稻品种N22中的表达明显受热胁迫诱导，由此表明含有逆境响应顺式作用元件的启动子在植物逆境胁迫响应过程中可能起到至关重要的作用.研究发现，水稻N22品种是最耐热的籼型常规稻，其在38 ℃高温下的生产率仍达到64%～86%[11].9311作为籼型常规稻，其品质优、产量高[12-13].日本晴属粳亚种，对温度和日照长度无特殊响应[14].此外，本研究发现OsBBX30蛋白提高了大肠杆菌对高温的耐受性，进一步证明OsBBX30与生物耐受热胁迫存在联系.OsBBX30表达受热胁迫诱导的特征为深入了解水稻的耐热分子信号传导途径提供了新的思路，为水稻抗逆分子育种提供了新的参考，为全面了解水稻抗逆的分子机制奠定了基础.参考文献[1]申秋硕，陈信波，张先文，等.三个逆境相关的水稻启动子克隆与瞬时表达分析[J].中国生物工程杂志，2012，32（ 11）：29-34.[2]黎毛毛，廖家槐，张晓宁，等，江西省早稻品种抽穗扬花期耐热性鉴定评价研究[J]. 植物遗传资源学报，2014，15（5）：919-925.LI Maomao， LIAO Jiahuai， ZHANG Xiaoning， et al. 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