微生物蛋白MCP测定方法

揭秘蛋白质相对分子质量测定：常用方法全面解析蛋白质是生物体内重要的功能分子，其相对分子质量的测定对于了解蛋白质的结构和功能至关重要。

本文将介绍常用的蛋白质相对分子质量测定方法，包括凝胶电泳、质谱分析和光学方法。

图1。

1. 凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质相对分子质量测定方法。

它通过将蛋白质样品分离成不同的带状条带，根据条带的迁移距离和已知分子质量的标准品进行比较，可以推断出待测蛋白质的相对分子质量。

1.1 SDS-PAGESDS-PAGE是一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，通过使用阴离子表面活性剂SDS 使蛋白质带负电荷，使其在电场中按照分子质量大小进行迁移。

通过与已知分子质量的标准品比较，可以确定待测蛋白质的相对分子质量。

1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离方法，通过将蛋白质样品在凝胶中进行电泳，根据蛋白质的分子质量和电荷特性，使其在凝胶中形成不同的带状条带，从而推断出蛋白质的相对分子质量。

2. 质谱分析质谱分析是一种高灵敏度的蛋白质相对分子质量测定方法。

它通过将蛋白质样品离子化，并在质谱仪中进行分析，根据离子的质荷比和丰度，可以推断出蛋白质的相对分子质量。

2.1 MALDI-TOF质谱MALDI-TOF质谱是一种常用的质谱分析方法，它通过将蛋白质样品与基质混合后，通过激光脱附离子化，然后通过飞行时间质谱仪进行分析。

根据离子的质荷比和丰度，可以推断出蛋白质的相对分子质量。

2.2 ESI-MS质谱ESI-MS质谱是一种常用的质谱分析方法，它通过将蛋白质样品在电喷雾离子源中离子化，然后通过质谱仪进行分析。

根据离子的质荷比和丰度，可以推断出蛋白质的相对分子质量。

3. 光学方法光学方法是一种非常便捷的蛋白质相对分子质量测定方法。

它通过测量蛋白质在特定波长下的吸光度，根据比色法或比浊法，可以推断出蛋白质的相对分子质量。

3.1 比色法比色法是一种常用的光学方法，通过测量蛋白质在特定波长下的吸光度，根据已知浓度的标准品和比色曲线，可以推断出待测蛋白质的相对分子质量。

测定蛋白质含量的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、考马斯亮蓝法等。

1、凯氏定氮法：准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，向1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化，之后进行蒸馏。

全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

2、双缩脲法：是一种用于鉴定蛋白质的分析方法。

双缩脲试剂呈蓝色，是一种碱性含铜测试溶液，它由几滴1%硫酸铜，1%氢氧化钾和酒石酸钾钠制成。

3、考马斯亮蓝法：基本原理是基于蛋白质可以与考马斯亮蓝G-250定量结合。

常见蛋白检测方法常见蛋白检测方法的新表述引言：蛋白质是细胞内最重要的生物大分子之一，它们在调控细胞功能和生物过程中扮演着关键的角色。

因此，准确地检测和定量蛋白质对于研究生物学和医学领域的科学家和医生来说至关重要。

在过去的几十年里，有许多蛋白质检测方法被广泛使用，但是随着技术的发展和创新，我们现在可以提出一些新的表述和方法来更好地满足研究的需求。

一、免疫测定法的新变革传统的免疫测定法如酶联免疫吸附法（ELISA）已经被广泛应用于蛋白质检测中。

然而，这些方法存在一些局限性，例如需要复杂的实验步骤、较长的操作时间和高成本。

在这方面，新兴的技术例如单分子荧光扩增技术（SuperNova）和荧光标记纳米颗粒技术（NanoFlare）等提供了一种更灵敏和快速的替代方案。

这些方法利用了纳米颗粒、荧光信号放大以及高通量技术，极大地提高了蛋白质检测的灵敏度和准确性。

二、质谱分析的创新应用质谱分析是一种重要的蛋白质检测方法，通过测量蛋白质片段的质荷比来鉴定和定量蛋白质。

随着技术的进步，质谱分析在检测上的应用也在不断创新。

例如，代谢组学质谱分析可以通过测量细胞或生物体液中的代谢物来评估蛋白质的功能和代谢网络。

此外，新兴的方法如并行反应监测技术（PRM）和靶向代谢组学（TMA）也可以提供更高的检测速度和准确度。

三、蛋白质芯片技术的发展蛋白质芯片技术是一种高通量蛋白质检测方法，通过将蛋白质固定在芯片上，实现对数百个甚至数千个蛋白质的同时检测。

这个领域的最新发展是将蛋白质芯片与质谱分析相结合，从而实现了高通量的蛋白质定量和鉴定。

这种技术的优势在于能够同时检测多个蛋白质，并提供高度准确的结果。

结论：随着技术的不断发展，我们现在可以提出一些新的表述和方法来改进蛋白质检测。

新兴的技术如SuperNova、NanoFlare、代谢组学质谱分析、PRM、TMA以及蛋白质芯片技术的发展，提供了更加灵敏、准确和快速的蛋白质检测方法。

这些新方法的应用将有助于我们更全面、深入地理解蛋白质的功能和其在生物过程中的作用。

上海笃玛生物科技有限公司本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断人（Human）单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）ELISA 检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。

3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。

3000转离心10分钟取上清。

5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

上海笃玛生物科技有限公司5.所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL 3mL 无检测抗体-HRP 10mL 5mL 无20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释底物A 6mL 3mL 无底物B 6mL 3mL 无终止液6mL 3mL 无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、20、40、80、160、320pg/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(microKjeldahlmethod) 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。

生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。

凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.实验原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。

生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。

凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。

其原理如下：1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。

为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。

这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2.加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3.滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。

此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。

HCl＋NaOHNaCl+H2O本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。

1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网微量凯氏蒸馏装置示意图试剂和器材一、试剂浓硫酸；30％过氧化氢溶液；10M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。

指示剂：0.1％甲基红乙醇溶液。

二、测试样品牛血清白蛋白。

3.1.1 蛋白质含量第一法紫外吸收法（见EPO）用4g/L的碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，作为供试品溶液。

以4g/L的碳酸氢铵溶液作为可被，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm 和350nm的吸光度。

用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。

紫外-可见分光光度法，在波长276~280nm处，测定供试品的溶液最大吸光度A max，将A max对应波长代入回归方程，求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散色。

计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。

蛋白质含量(mg/ml)=(A max -A光散色)/ 7.43 x 供试品稀释倍数x 10。

1.仪器的校正和鉴定1)波长允许误差：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm2)吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。

3)杂散光碘化钠、亚硝酸钠2.测定法，1)对照品比较法(c x)= (A x/A R) c R，其中c x为供试品浓度；A x 为供试品溶液的吸光度c R为对照品浓度；A R为对照品溶液的吸光度。

2)吸收系数法通常吸收系数大于1003)计算分光光度法4)比色法第二法Lowry法本法用于微量蛋白质的含量測定。

蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。

试剂1〉酚试剂称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10小时。

取下回流管，加入硫酸锂150g 、水50ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴，冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。

蛋白浓度测定的方法蛋白质是生物体内的重要物质，对于许多实验室研究和临床诊断都有着重要的意义。

因此，准确测定蛋白质的浓度是非常关键的。

目前，常用的蛋白质浓度测定方法主要有生物学素法、分光光度法、BCA法、Lowry法、Bradford法和尿素法等。

下面将分别介绍这些方法的原理和操作过程。

1.生物学素法：生物学素法是一种通过测定蛋白质与棒状素之间的结合来确定蛋白质浓度的方法。

这种方法主要应用于血浆、血清和尿液等样品的蛋白质测定。

实验方法如下：a.准备一组具有不同浓度的棒状素溶液。

b.将待测蛋白质溶液与棒状素一起孵育一段时间。

c.通过酸甲醛试剂对母液进行反应，并测量光密度。

d.制作标准曲线，并根据待测样品的光密度与标准曲线的关系计算蛋白质浓度。

2.分光光度法：分光光度法是一种通过测定蛋白质对特定波长的紫外光吸收量来计算浓度的方法。

这种方法适用于纯度较高的蛋白质样品。

实验方法如下：a. 准备一组蛋白质标准溶液，并使用光度计测量其在280nm波长处的吸光度。

b.将待测蛋白质样品的吸光度值与标准溶液的吸光度值进行比较，并计算浓度。

3.BCA法：BCA法是一种通过测定蛋白质与巴氏试剂之间的反应产生的紫色络合物的吸光度来计算蛋白质浓度的方法。

该方法对于各种类型的蛋白质样品都适用。

实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入BCA试剂。

b.将待测蛋白质样品与BCA试剂孵育一段时间。

c.使用光度计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。

4. Lowry法：Lowry法是一种经典的蛋白质浓度测定方法，通过低里试剂和碱式铜试液与蛋白质样品反应，产生紫色或蓝色化合物，并通过比色计测量光密度来计算蛋白质浓度。

实验方法如下：a.准备一组蛋白质标准溶液，并加入低里试剂和碱式铜试液。

b.将待测蛋白质样品与低里试剂和碱式铜试液反应一段时间。

c.使用比色计测量吸光度，并通过标准曲线计算浓度。

5. Bradford法：Bradford法是一种快速、敏感且广泛应用的蛋白质浓度测定方法，通过考虑到蛋白质在酸性溶液中与染料试剂环氧化苏丹蓝的特异性作用来计算浓度。

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(microKjeldahlmethod) 生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。

生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。

凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.实验原理生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。

生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。

凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。

其原理如下：1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。

为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。

这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2.加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH,加热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3.滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。

此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。

HCl＋NaOHNaCl+H2O本法适用于0.2~2.0mg的氮量测定。

1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网微量凯氏蒸馏装置示意图试剂和器材一、试剂浓硫酸；30％过氧化氢溶液；10M氢氧化钠；0.01M的标准盐酸；标准硫酸铵（0.3mg氮/mL）催化剂：硫酸铜：硫酸钾＝1：4混合，研细。

指示剂：0.1％甲基红乙醇溶液。

二、测试样品牛血清白蛋白。

大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因序列分析及PCR快速检测方法的建立马冬梅;白俊杰;邓国成;李胜杰;叶星;江小燕【摘要】为了早期快速诊断近年来流行于广东省养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)中的病毒性溃疡综合征,本研究用基因组步移的方法获得了大口黑鲈溃疡综合征病毒(Largemouth bass ulcerative syndrome virus,LBUSV)主要衣壳蛋白(MCP)基因,该基因编码区全长1392bp.通过序列比较分析,在MCP基因内确定了一段241bp的特异性较强的片段作为靶序列,设计并合成引物,经过优化PCR反应条件,建立了可以快速检测大口黑鲈溃疡综合征病毒的PCR方法.实验表明,在PCR进行到30个循环反应时可以榆测到的质粒最小浓度是104拷贝数/Μl,相当于104个病毒粒子.利用该方法,从天然感染LBUSV的大口黑鲈脾脏组织DNA可扩增出241bp的片段,而健康大口黑鲈和感染了传染性脾肾坏死病毒样病毒的大口黑鲈脾脏组织则没有扩增条带.本研究建立的PCR检测方法具有检测快速、成本低、准确性高的特点,适用于大范围早期病害诊断的推广应用.【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2010(017)006【总页数】8页(P1149-1156)【关键词】大口黑鲈溃疡综合症病毒;大口黑鲈;虹彩病毒;主要衣壳蛋白;序列分析;PCR检测【作者】马冬梅;白俊杰;邓国成;李胜杰;叶星;江小燕【作者单位】中国水产科学研究院,珠江水产研究所,中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,广东,广州,510380;中国水产科学研究院,珠江水产研究所,中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,广东,广州,510380;中国水产科学研究院,珠江水产研究所,中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,广东,广州,510380;中国水产科学研究院,珠江水产研究所,中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,广东,广州,510380;中国水产科学研究院,珠江水产研究所,中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,广东,广州,510380;中国水产科学研究院,珠江水产研究所,中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,广东,广州,510380【正文语种】中文【中图分类】S94大口黑鲈(Micropterus salmoides), 俗名加州鲈, 具有生长快、耐低温、肉质鲜美和容易起捕等特点, 从 20世纪 70年代开始推广到世界各地, 中国目前大口黑鲈的年产量约为10万t[1-2]。