酶工程
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名词解释1. 酶工程:又叫酶技术,是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
2.自杀性底物:底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露,再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂,这种底物叫自杀性底物??3.别构酶;调节物与酶分子的调节中心结合后,引起酶分子的构象发生变化,从而改变催化中心对底物的亲和力,这种影响被称为别构效应,具有别构效应的酶叫别构酶4.诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成,当加入诱导物后就会大量合成,这样的酶叫诱导酶5.Mol 催化活性:表示在单位时间内,酶分子中每个活性中心转换的分子数目6. 离子交换层析9比活力11葡萄糖效应13产酶动力学15双向凝胶电泳20固定化细胞21酶化学修饰1.酶的转换数:酶的转换数Kp。
又称为摩尔催化活性,是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。
2.酶的催化周期:酶进行一次催化所用的时间。
3.固定化酶的比活力:指每克干固定化酶所具有的6活力单位数,它是酶制剂纯度的一个指标。
4.抗体酶:又称催化行抗体。
是一类具有生物催化功能的抗体分子。
抗体是由抗原诱导产生的抗原特异结构免疫球蛋白,要使机体具有生物催化功能,只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性,以及酶的高效催化能力。
是通过人工设计采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化剂,有些是自然界原本不存在的。
5.端粒酶:是一种核酸核蛋白,包含蛋白质和RNA两种基本成分。
其RNA组分包含有构建端粒的重复序列的核苷酸摸板序列,在合成端粒的过程中,端粒酶以其本身的RNA组分为摸板把端粒的重复序列加到染色体DNA的末端上,使端粒延长。
6.核酶:核酸类酶。
为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子。
它可以催化本身RNA剪切或剪接作用,还可以催化其他RNA,DNA多糖,酯类等分子进行反应。
7.KS分段盐析:指在一定温度和PH值条件下,通过改变离子强度使不同的酶和蛋白质分离的方法。
8.B分段盐析:指在盐和离子强度条件下,通过改变温度和PH使不同的酶或蛋白质分离的方法。
第一章绪论酶工程:酶的生产、改性和应用的技术过程。
酶的生产(enzyme production):通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程,主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。
酶的改性(enzyme improving ):通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程,主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。
酶的应用(enzyme application):通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程,主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。
酶工程的主要内容包括微生物细胞发酵产酶,酶的提取与分离纯化,酶分子修饰,酶、细胞和原生质体固定化,酶的非水相催化,酶反应器和酶的应用等。
酶工程的主要任务是经过预先设计,通过人工操作,获得人们所需的酶;并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。
酶是一类具有催化功能的生物大分子,亦称生物催化剂。
酶的分类:1、氧化还原酶(oxidoreductase)2、转移酶(transferase)3、水解酶(hydrolase)4、裂解酶(或裂合酶lyase)5、异构酶(isomerase)6、合成酶(synthease)或连接酶(ligase)酶的催化特性:高效性、高度专一性、反应条件温和且活力可调节影响酶催化反应速率的因素:底物浓度的影响,酶浓度的影响,pH、温度的影响,抑制剂的影响,激活剂的影响米氏方程式:[S]:底物浓度V:不同[S]时的反应速度V max:最大反应速度(maximum velocity)Km:米氏常数(Michaelis constant)米氏常数Km的意义:☐重要特征物理常数,与酶浓度无关。
不同的酶具有不同K m值☐物理意义:Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
☐Km值只是在固定的底物,一定的温度和pH条件下,一定的缓冲体系中测定的,不同条件下具有不同的Km值。
☐K m值近似等于[ES]的解离常数,可表示酶与底物之间的亲和力:K m值大表示亲和程度小,酶的催化活性低; K m值小表示亲和程度大,酶的催化活性高☐从k m可判断酶的专一性和天然底物。
酶工程:又称酶工艺,是围绕酶所特有的催化性能使其在工业、农业医疗保健事业及其其它各方面发挥作用的应用技术,主要为酶制剂的生产和应用。
酶工程的主要内容:1酶的发酵和产2酶的分离纯化3酶和细胞的固定化4酶的分子修饰5酶的发应动力学和反应器6酶电板/酶传感器7酶的应用8有机介质中的酶反应9抗体酶,人工酶和模拟酶使用微生物进行酶生产时,利用微生物的优点:1微生物的种类多,酶种丰富,菌株易诱变2微生物生长繁殖快,易提取酶3培养基价格便宜,微生物培养不受季节,地理限制4发酵生产易自动控制5易获得工程菌,提高酶产率,开发新酶培养基营养成分:碳源,氮源,无机盐,微量元素,生长因子,产酶促进剂发酵条件对产酶的影响因素:温度,PH,通气量,搅拌,泡沫,湿度提高酶产量的方法:1选育优良的产酶细胞株系2添加诱导物3控制阻遏物浓度4添加表面活性剂5添加产酶促进剂提高植物细胞产物产量的途径:1选择高产出的细胞株2代谢途径的调节3控制细胞生长和分化程度4诱导物或加入前体5两相培养及次生产物的释放6毛状根(发根)培养技术酶发酵动力学:研究在发酵过程中细胞生长速度,产物生成以及环境因子对这些速度的影响。
酶的分离纯化:包括三个基本环节:一是抽提,即把酶从材料转入溶剂中来制成酶溶液;二是纯化,即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来;三是制剂,即将酶制成各种剂型。
三个基本原则:1、注意防止酶的变性失活:(1)除少数情况外,所有操作必须在低温下进行,特别是有机溶剂存在时更要特别小心;(2)大多数酶在PH<4或PH>10的条件下不稳定,故不能过酸过碱(3)酶溶液常易形成泡沫而使酶变性,故应防止泡沫的形成(4)重金属能引起酶失活,有机溶剂能使酶变性,微生物污染,蛋白质使酶变性,都必须予以防止2、酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去,因此,在不破坏所需酶的条件下,可使用各种“激烈”手段。
此外,由于酶和它的底物,抑制剂等具有亲和性,当这些物质存在时,酶的理化性质和稳定性发生了一定变化,从而提供了更多条件和方法可供采用3、酶具有催化活性,检测酶活性,跟踪酶的来龙去脉,为选择适当的方法和条件提供了直接依据。
第一章绪论(资料来自来自一班)一名词解释,填空1 酶的变性与失活失活作用:凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。
2 酶的回收率与纯化比3 酶的结合效率及酶活力回收率酶的结合效率又称酶的固定化率,是指酶与载体结合的百分率酶的结合效率=(加入的总酶活力-未结合的酶活力)/加入的总酶活力*100%酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率酶活力回收率=固定化酶总活力/用于固定化的总酶活力*100%4 底物抑制及其产生的三个原因(1)、竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似,因而能与底物竟争与酶活性中心结合。
当抑制剂与活性中心结合后,底物被排斥在反应中心之外,其结果是酶促反应被抑制了(2)、非竟争性抑制酶可以同时与底物及抑制剂结合,但是,中间产物ESI不能进一步分解为产物,因此,酶的活性降低。
(3)、反竞争性抑制作用酶只有在与底物结合后,才能与抑制剂结合,引起酶活性下降。
二问答题1 什么是酶工程?酶工程(Enzyme Engineering))又称为酶技术,是指酶的生产与应用的技术过程。
是将酶学理论与化工技术、微生物技术结合起来利用酶的催化作用进行物质转化的技术它是借助工程学手段利用酶或细胞、细胞器的特定功能提供产品的一门科学。
就酶工程本身的发展来说,包括下列主要内容:酶的产生、酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造、有机介质中的酶反应、酶传感器、酶反应器、抗体酶、人工酶和模拟酶2 什么是酶的最适PH及其影响酶的反应机理在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适pH(optimum pH)。
a.过酸或过碱影响酶蛋白的构象,使酶变性失活。
b.影响酶分子中某些基团的解离状态(活性中心的基团或维持构象的一些基团)c.影响底物分子的解离状态故酶反应一般在一定的缓冲液体系中进行3 简述酶活力的测定方法(要求:快速,两个阶段,四个步骤)要求:快速、简便、准确两个阶段:酶在一定条件下与底物反应一段时间然后再测定反应物中底物或产物的浓度变化量。
步骤:(1)配制底物溶液。
(2)确定反应条件。
(3)反应开始,记时间(4)反应完毕注意终止反应。
(5)测定产物的生产量或底物的减少量。
4 磺胺类药物的作用机理(竞争性) (资料上有)5 影响酶催化作用的因素(1)底物浓度对酶促反应速度的影响在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比,表现为一级反应特征。
当底物浓度达到一定值,反应速度达到最大值(V max),此时再增加底物浓度,反应速度不再增加,表现为零级反应(2)酶浓度对酶反应速度的影响在底物浓度足够高的条件下,酶催化反应速率与酶的浓度成正比(3)温度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。
另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性,导致酶活性降低甚至丧失。
因此大多数酶都有一个最适温度。
在最适温度条件下,反应速度最大。
酶对温度的耐受力与其存在状态有关(4)pH 的影响在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适pH(optimum pH)。
a.过酸或过碱影响酶蛋白的构象,使酶变性失活。
b.影响酶分子中某些基团的解离状态(活性中心的基团或维持构象的一些基团)c.影响底物分子的解离状态故酶反应一般在一定的缓冲液体系中进行(5)抑制剂的影响抑制剂:不引起酶蛋白变性,但能使酶分子上某些必需基团(活性中心上一些基团)发生变化,引起酶活性下降,甚至丧失,此类物质称为酶的抑制剂。
(6)激活剂对酶反应速度的影响凡能提高酶活性的物质,都称为激活剂(1)无机离子:金属离子(K+ Na+ Mg2+ Zn2+ Fe2+ Ca2+)、阴离子(Cl- Br-)、氢离子(2)中等大小的有机分子:某些还原剂、乙二胺四乙酸(EDTA)(3)某些酶类:酶原激活过程中的酶类原理:a.酶活性中心的必需基团 b.酶-底络合物形成的桥梁c.作为某些酶的辅助因子d.保护-SH酶不被氧化6 举例说明研究抑制剂对酶作用的重大意义(1)药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发:抗癌药(2)对生物体的代谢途径进行人为调控,代谢控制发酵(3)研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团,不仅可以设计农药,而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础第二章微生物发酵产酶一名词解释1 诱导与阻遏2 最适生长温度与最适生产温度3 生长因子细胞生长繁殖不可缺少的微量有机化合物,如aa, 嘌呤,嘧啶,激素二填空1 常用产酶的微生物有产@酶的微生物有(资料上有)2 常识性问题酶工程的发展历史过程三问答题1 如何选择产酶的菌种?五个方面(菌种致病,产胞外酶的菌种)1、发酵周期短,产量高;2、容易培养和管理;3、产酶稳定性好,不易变异退化,不易被感染;4、有利于酶的分离和纯化;5、安全性可靠,非致病菌。
2 酶的发酵生产中提高酶生产的措施有?酶合成的调节机制:在正常情况下,酶产量受酶合成调节机制的控制,要提高酶产量必须打破这种调节控制。
酶合成主要取决于转录水平的调节,原核生物中普遍公认的调节机制是操纵子理论。
打破酶合成调节限制的方法:1、添加诱导物同一种酶往往能被多种诱导物同一种诱导物酶也能诱导多种酶诱导物一般可分为3类:酶的作用底物、酶的反应产物、酶的作用底物的类似物(最有效)2、控制阻遏物浓度3、添加表面活性剂4、添加产酶促进剂3 四种酶生物合成模式的特点,作用,原因,在工业生产中如何利用?(1)同步合成型酶的合成与生长同步进行。
米曲霉可由单宁诱导生成鞣酸酶(单宁酶)酶的生物合成可以诱导,但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。
这类酶所对应的mRNA很不稳定(2)延续合成型1)、酶的合成伴随着细胞的生长而开始,但在细胞生长进入稳定期后,酶还可以延续合成较长的一段时间。
2)酶的生物合成可以诱导,一般不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。
3)这类酶所对应的mRNA相当稳定,在生长稳定期以后相当长的一段时间内继续用于酶的合成(3)中期合成型1)酶合成在细胞生长一段时间以后才开始,而在细胞进入平衡期后,酶的合成也随着停止。
2)枯草杆菌碱性磷酸酶,无机磷反馈阻遏3)酶的生物合成受到反馈阻遏,而且其所对应的mRNA不稳定。
(4)滞后合成型1)只有当细胞生长进入平衡期后,酶开始合成并大量积累,如许多水解酶2)酶的生物合成受分解代谢物阻遏作用,这类酶所对应的mRNA稳定性高。
4 在生产实践中,试述酶生产合成模式及各模式的特点,最重要的模式是哪几种?(资料上有)5 固定化细胞发酵有何优点?1、提高产酶率2、可在高稀释率条件下连续发酵3、发酵稳定性好4、缩短发酵周期,提高设备利用率5、产品容易分离纯化6、适于胞外酶等胞外产品的生产6 简要介绍原生质体的制备过程,固定化原生质体有何特点?(资料上有)7 打破酶合成调节限制的方法有哪几种?即增加酶产物的措施1、添加诱导物同一种酶往往能被多种诱导物同一种诱导物酶也能诱导多种酶诱导物一般可分为3类:酶的作用底物、酶的反应产物、酶的作用底物的类似物(最有效)2、控制阻遏物浓度3、添加表面活性剂4、添加产酶促进剂第三章动植物细胞培养产酶一填空植物细胞培养的一般控制流程:外植体→细胞的获取→细胞培养→分离纯化→成品(酶)二问答1 简述植物细胞产酶的工艺流程(资料上有)2 以黑色素瘤细胞生产组织酶原为例说明细胞培养产酶的工艺流程控制及步骤(资料上有)第四章酶的提取与分离一名词解释1 等电点沉淀(资料上有)2 盐析沉淀(资料上有)二问答1 在酶提取分离纯化中细胞破碎方法有哪些?组织细胞的破碎方法很多,有机械方法、物理方法、化学方法和生物化学方法等1 机械法1)组织捣碎机(捣碎法)2)研磨法利用研钵、石磨、球磨、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎。
3)匀浆法利用匀浆器所产生的剪切力持组织细胞破碎。
2.物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用,使组织细胞破碎的方法,统称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
1)温度差破碎法2)压力差破碎法3)超声波破碎法3.化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用,使细胞膜的结构改变或破坏的方法。
常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。
4.酶促破碎法在一定条件下,通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用使细胞破碎。
第五章酶分子修饰一名词解释1 酶分子修饰(资料上有)2 分子内交联修饰(资料上有)3 酶的有限水解修饰若采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位点断裂,其分子质量减少,就可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗原性降低或消失,这种修饰有限水解修饰4 酶的定点突变技术(资料上有)5 侧链基团修饰采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰二填空1 通过酶分子修饰可以使酶分子结构发生哪些改变可能提高酶的活力,增强酶的稳定性,降低或消除酶的抗原性等。
2 金属离子置换修饰的步骤(1) 酶的分离纯化(2) 除去原有的金属离子(3) 加入一种金属离子置换三问答1 对酶进行化学修饰时应考虑哪些因素?2 以单甲氧基聚乙二醇(MPEG)的活化及对酶的修饰阐述大分子修饰的方法与步骤(资料上有)3 什么是酶的定点突变技术,方法与步骤?(资料上有)4 什么是抗体酶,试述以单克隆抗体法制备抗体酶的机理(资料上有)第六章酶,细胞,原生质体固定化一名词解释1 固定化酶(资料上有)二填空1 游离酶应用中有哪三个不足?(资料上有)2 固定化酶的优点(资料上有)3 通常采用酶的固定化方法大体可分为吸附法、结合法、交联法、包埋法和热处理法等4 采用海藻酸钙凝胶包埋的步骤将一定量的海藻酸钠溶于水配成溶液,经杀菌冷却后,与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀,然后滴入到一定浓度的氯化钙溶液中,形成球状固定化细胞胶粒。
5 溶解植物细胞壁的酶有纤维素酶和果胶酶用于处理植物细胞壁根据细胞壁主要成分的不同选用合适的酶溶菌酶用于细菌原生质体制备; -葡聚糖酶可作用于酵母细胞壁;霉菌细胞壁成分较复杂,需用几丁质酶和其他相关酶的共同作用;纤维素酶和果胶酶用于处理植物细胞壁三问答1 试述葡萄糖氧化酶电极的工作原理(测量血糖含量)(资料上有)2 什么是酶固定化?主要方法有哪些?通常采用的固定化方法可大体概括为:吸附法、结合法、交联法、包埋法和热处理法等。
1吸附法通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
根据吸附剂的特点又分为两种:物理吸附和离子交换吸附。
2、包埋法:(1)凝胶包埋法:将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成的固定化酶。
天然凝胶:琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等;合成凝胶:聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。
(2) 半透膜包埋法(微囊化法):a.界面沉淀法:利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜将酶包埋。