一种耐热性植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究_王国坤

耐热碱性蛋白酶产生菌株的分离鉴定及酶学性质研究的开题报告一、研究背景及意义耐热碱性蛋白酶是一种有重要应用价值的酶，广泛应用于医药、食品、皮革、环境保护等行业中。

其特点是能在高温高碱环境下稳定地存在和发挥作用，因此受到了广泛关注。

目前，已经有许多研究针对耐热碱性蛋白酶的产生菌株、分离鉴定及酶学特性进行了探究，但在实际应用中，仍存在一些问题需要解决，如酶的稳定性、效率和产量等方面，因此有必要进一步深入研究。

二、研究内容和方法本研究旨在分离鉴定耐热碱性蛋白酶产生菌株，并研究其基本酶学性质，为酶的进一步研发应用提供参考。

具体研究内容如下：1. 采集多种自然环境中的样品，如土壤、水、植物、动物等，通过培养分离的方式筛选产生耐热碱性蛋白酶的菌株；2. 对所得到的菌株进行形态学特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定，筛选出优良的菌株；3. 通过固体和液体发酵的方法大量制备菌株产生的耐热碱性蛋白酶；4. 研究酶的基本酶学性质，包括最适温度、最适pH值、热稳定性、抑制剂对酶的影响等；5. 对酶的酶动力学特性进行研究，包括酶的动力学常数、Michaelis-Menten方程、反应速率等。

三、预期结果本研究将分离鉴定出优良的耐热碱性蛋白酶产生菌株，并对酶的基本酶学性质和酶动力学特性进行研究，预计能够得到以下结果：1. 获得产生耐热碱性蛋白酶的优良菌株，为耐热碱性蛋白酶的基础研究和产业应用提供了可靠的物质基础；2. 揭示耐热碱性蛋白酶的基本酶学性质和酶动力学特性，为其进一步应用提供理论支持；3. 为该领域的后续研究提供实验方法和实验结果的参考，推动本领域的发展。

四、研究难点及解决思路本研究面临的主要难点在于如何获得稳定、高效率和高产量的耐热碱性蛋白酶，以及如何解决酶在产业应用中的稳定性问题。

针对这些问题，我们将采取以下解决思路：1. 进行大量的筛选和优化实验，从多个样品中挑选最适合的菌株进行培养和发酵；2. 通过改变培养条件、添加助剂等方法，优化酶的产量和活性，使其符合产业应用的需求；3. 在产业应用中，注意酶的保护和稳定性，避免不必要的失活和损失。

植酸酶在饲料中的应用研究与展望
朱梅梦;王军;陈建欣
【期刊名称】《饲料广角》
【年(卷),期】2002(000)018
【摘要】@@ 植酸酶(Phytase)作为饲料添加剂的一个品种,得到饲料工业和养殖业的普遍重视和广泛应用.畜禽饲料中的主要成分是植物性饲料,其中70%以上的磷元素以植酸盐的形式存在.一方面,由于单胃动物消化道内缺少植酸酶,以植酸形式存在的植酸磷很少能被利用;另一方面,饲料生产中需要添加价值昂贵的商品磷源.所以,在畜禽饲料中加入植酸酶,既能提高饲料的消化率、利用率及生产性能,又能减少畜禽排泄物中磷的含量,保护水土免受污染.随着我国加入WTO,全面融入全球经济一体化,要想打破阻碍我国畜产品进入国际市场的绿色壁垒,必须研发绿色饲料添加剂.因而,植酸酶作为一类高效、无毒无副作用和环保型绿色饲料添加剂,不仅是一种非常规优势饲料资源,同时也提高现有常规饲料资源的利用率,在21世纪将有着十分广阔的应用前景.
【总页数】3页(P22-24)
【作者】朱梅梦;王军;陈建欣
【作者单位】吉林粮食高等专科学校;吉林粮食高等专科学校;吉林粮食高等专科学校
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
【相关文献】
1.微生物植酸酶在家禽饲料中的应用研究进展 [J], 黄志勇;崔红;徐帅;张桂凤
2.植酸酶在生长猪饲料中的应用研究 [J], 付惠玲
3.水产饲料中植酸酶的应用研究 [J], 黄云;胡毅;毛小伟;郇志利;李金龙
4.植酸酶在猪饲料中的应用研究 [J], 王振华
5.植酸酶及其在畜禽饲料中的应用研究进展 [J], 宫宇;姚玲珑;陈清华;陈凤鸣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一种耐热植酸酶的生物化学特性的研究的开题报告
题目：一种耐热植酸酶的生物化学特性的研究
背景：
植酸盐是植物种子和谷物中的主要磷质形式，但植酸会抑制人和动物对营养物质的吸收，在高剂量摄入的情况下还可能对肠道健康产生负面影响。

因此，一种有效的
植酸酶可以去除植酸并提高食品的营养价值。

同时，由于植物残留物的处理也是农业
和食品工业中的重要问题，植酸酶可以被用于消化糠秕、豆渣等植物残留物。

要点：
近年来，随着耐热酶的发展和应用，一些新的耐热植酸酶被发现，并被广泛研究。

本研究旨在从一种耐热植酸酶中发现其生物化学特性，并探索其在食品工业和农业上
的应用。

方法：
首先从样品中分离目标酶，并使用SDS-PAGE对酶进行鉴定。

接下来，通过对酶的催化反应条件的优化，包括温度、pH值和底物浓度等，确定酶的最适催化条件。

然后通过热失活实验和CD光谱检测，探究酶的耐热性和构像变化。

最后，结合反应动力学、酶动力学和分子生物学等方法，研究酶的催化机制。

意义：
本研究将有助于了解耐热植酸酶的生物化学特性，为其在食品工业和农业中的应用提供了理论基础和实验支持。

同时，也为探索新型耐热酶的催化机制提供了研究思路。

植酸酶高产菌株的选育及酶的分离纯化和性质研究的开题报告一、选题背景和研究意义植酸是存在于豆类、谷类、油料、棉花籽等植物种子中的一种主要磷源，可作为家禽、家畜饲料添加剂，在农业生产中具有重要的应用价值。

然而，植酸作为一种反式结构的磷酸盐与矿物质结合紧密，难以被家禽、家畜消化吸收，导致营养物质的浪费。

因此，研究植酸酶的生物学特性和应用具有重要的理论和现实意义。

植酸酶是一种能够水解植酸为无机磷酸盐和次生代谢产物的酶，广泛存在于真菌、细菌和植物中。

通过筛选高效的植酸酶产生菌株，研究酶的分离纯化和性质，可以为实现植酸酶的工业化生产提供技术支持。

二、研究内容和目标本研究的主要内容包括选育高产植酸酶的细菌菌株、酶的分离纯化及性质研究。

具体目标如下：1. 通过菌落形态、生理生化特性及酶活性等方面的综合分析，筛选出高产植酸酶的细菌菌株；2. 采用离子交换、凝胶过滤等方法对酶进行初步的分离纯化，并对纯化后的酶进行酶活测定和SDS-PAGE电泳分析；3. 研究酶的最适温度、最适pH、热稳定性、储藏稳定性等性质。

三、研究方法和技术路线1. 选育高产菌株的方法：分离土壤中的细菌，并通过菌落形态、氧气需求条件、革兰氏染色、生理生化试验、文献查阅等手段，筛选出高产植酸酶的菌株；2. 酶的分离纯化：采用盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和柱层析等方法分离纯化酶，用不同浓度NaCl进行纯化后测定酶活，用SDS-PAGE电泳分析纯化后的酶的分子量；3. 酶性质的研究：测定酶的最适温度、最适pH、热稳定性、储藏稳定性等性质。

四、研究预期成果1. 筛选出高产植酸酶的细菌菌株，为后续工业化生产提供选育菌株的参考；2. 纯化出植酸酶，研究其最适温度、最适pH、热稳定性等性质，为酶的应用提供基础和参考，同时为植酸酶的工业化生产提供技术支持；3. 为解决植酸酶工业化生产中的技术难题，提供新的研究思路和方向，推动植酸酶的应用和推广。

耐热植酸酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学特性王兴吉㊀刘文龙∗㊀盛花开㊀王克芬(山东隆科特酶制剂有限公司ꎬ山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室ꎬ山东临沂㊀２７６４００)㊀㊀摘㊀要:植酸酶能催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐ꎬ在食品㊁医药㊁饲料等方面有广泛应用ꎮ本研究通过ＰＣＲ获得来源于地衣芽孢杆菌的耐热植酸酶基因Ｐ１ꎬ并在毕赤酵母中成功表达ꎬ得到重组菌ＢＰ－１ꎮＢＰ－１在ＢＭＭＹ表达培养基中植酸酶酶活４５９Ｕ/ｍＬꎬ该酶的最适作用ｐＨ５.０ꎬ最适作用温度为７０ħꎬ且具有良好的耐热性和耐酸碱性ꎬ在８０ħ条件下保温７０ｍｉｎꎬ酶活仍剩余８４％ꎬ８０－９５ħ保温２０ｍｉｎꎬ酶活损失小于２０％ꎬ在ｐＨ４.０－８.５条件下处理３０ｍｉｎꎬ酶活仍剩余８０％以上ꎮ关键词:毕赤酵母ꎻ植酸酶ꎻ耐热ꎻ耐酸碱ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＰｈｙｔａｓｅＧｅｎｅｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＷａｎｇＸｉｎｇｊｉ㊀ＬｉｕＷｅｎｌｏｎｇ∗㊀ＳｈｅｎｇＨｕａｋａｉ㊀ＷａｎｇＫｅｆｅｎ(ＳｈａｎｄｏｎｇＬｏｎｇＫｅｔｅＥｎｚｙｍｅＣｏ.ꎬｌｔｄ.ꎬＳｈａｎｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＬｉｎｙｉ２７６４００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｐｈｙｔａｓｅｃａｎｃａｔａｌｙｚｅｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｐｈｙｔｉｃａｃｉｄａｎｄｉｔｓｓａｌｔｓｔｏｉｎｏｓｉｔｏｌａｎｄｐｈｏｓ￣ｐｈａｔｅ.Ｉｔｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｆｏｏｄꎬｍｅｄｉｃｉｎｅꎬｆｅｅｄꎬｅｔｃ.ＴｈｅｐｈｙｔａｓｅｇｅｎｅＰ１ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ.ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎｗａｓｎａｍｅｄＢＰ－１.Ｔｈｅｐｈｙｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ４５９Ｕ/ｍＬｉｎｔｈｅＢＭＭＹｍｅｄｉｕｍ.ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｒｅａｃｔｉｏｎｐＨｏｆｔｈｅｐｈｙｔａｓｅｗａｓ５.０ꎬｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ７０ħ.Ｉｔｈａｄｇｏｏｄｔｈｅｒ￣ｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ.Ｔｈｅｐｈｙｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｍａｉｎｅｄ８４％ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆ８０ħｆｏｒ７０ｍｉｎｕｔｅｓꎬａｎｄ８０％ｏｆ８０－９５ħｆｏｒ２０ｍｉｎｕｔｅｓ.Ｔｈｅｐｈｙｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｍａｉｎｅｄａｂｏｖｅ８０％ｕｎｄｅｒｐＨ４.０－８.５ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒ３０ｍｉｎｕｔｅｓ.ＫｅｙＷｏｒｄｓ:ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉｓꎻＰｈｙｔａｓｅꎻＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙꎻＡｃｉｄ－ＡｌｋａｌｉＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ作者简介:王兴吉(１９７０－)ꎬ男ꎬ高级工程师ꎬ研究方向:酶制剂开发与应用ꎮ㊀㊀磷是动物机体必需的矿物元素ꎬ植酸(ｐｈｙｔｉｃａｃｉｄꎬ肌醇六磷酸)可以螯合金属离子ꎬ形成溶解度很低的植酸盐ꎬ是植物中磷的主要存储形式[１]ꎬ作用相当于抗营养因子ꎬ很难被单胃动物吸收ꎬ另外植酸还能络合蛋白质ꎬ抑制一些消化酶的活性[２]ꎮ植酸酶(ｐｈｙｔａｓｅ)能催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐ꎬ在动物饲料中添加植酸酶ꎬ不仅可以提高动物对磷等矿质元素㊁蛋白质㊁氨基酸等的利用率[３]ꎬ还能减少磷的排出对环境的污染[４]ꎬ另外植酸酶在食品㊁医药方面也有广泛应用[５]ꎮ虽然单胃动物缺乏能够利用植酸盐的植酸酶ꎬ但是可以通过微生物来大量合成ꎬ添加到饲料中供动物体利用ꎮ另外ꎬ食品㊁饲料等加工过程中的通常需要热处理ꎬ温度能达到７５－８０ħ[６]ꎬ因而植酸酶耐热性成为阻碍其广泛应用的一个重要问题ꎮ本研究将来源于地衣芽孢杆菌的耐热植酸酶基因在毕赤酵母中表达ꎬ以期得到高产耐热植酸酶的重组菌ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料与仪器１.１.１㊀菌种毕赤酵母ＧＳ１１５(Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ)ꎬ为山东隆科特酶制剂有限公司研发中心重点实验室保存ꎮ地衣芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ)ꎬ分离得到ꎬ为山东隆科特酶制剂有限公司研发中心重点实验室保存ꎮ１.１.２㊀培养基ＬＢ培养基:１％胰蛋白胨ꎬ０.５％酵母提取物ꎬ１％氯化钠ꎮＹＰＤ培养基:１％酵母膏ꎬ２％蛋白胨ꎬ２％葡萄糖ꎬ固体培养基加２％琼脂粉ꎮＭＤ培养基:１.３４％ＹＮＢꎻ４ˑ１０－５％生物素ꎻ２％葡萄糖ꎮＢＭＧＹ培养基配方[７]:１％酵母浸出物ꎬ２％蛋白胨ꎬ０.１ｍｏｌ/ＬｐＨ６.０磷酸盐缓冲液ꎬ１.３４％ＹＮＢꎬ４ˑ１０－５％生物素ꎬ１％甘油ꎮＢＭＭＹ培养基配方[７]:１％酵母浸出物ꎬ２％蛋白胨ꎬ０.１ｍｏｌ/ＬｐＨ６.０磷酸盐缓冲液ꎬ１.３４％ＹＮＢꎬ４ˑ１０－５％生物素ꎬ０.５％甲醇ꎮ１.１.３㊀试剂及原料胰蛋白胨㊁酵母提取物:美国ＢＤ公司ꎻ内切酶㊁聚合酶㊁连接酶:Ｔａｋａｒａ公司ꎻ胶回收试剂盒㊁质粒抽提试剂盒:天根生物ꎻ生物素:如吉生物ꎮ其他试剂均为国药集团分析纯ꎮ１.１.４㊀仪器与设备ＺＷＹ－２１１Ｃ恒温摇床㊁ＺＸＳＤ－ＡＩ２７０恒温培养箱㊁ＺＨＪＨ－ＣＩ２１４Ｂ超净工作台:智城分析仪器有限公司ꎻＰＣＲ仪㊁电泳仪:美国Ｂｉｏ－ＲａｄꎻＧＩ８０ＴＷ高压蒸汽灭菌锅:致微仪器ꎻＨＨ－２恒温水浴锅:上海梅香仪器ꎻ５８１０Ｒ型离心机:德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀植酸酶基因的获得[８]从本公司锅炉房附近土壤中分离得到一株地衣芽孢杆菌ꎬ其所产植酸酶具有耐热性ꎬ根据该基因的核苷酸序列设计ＰＣＲ引物ꎬ５'端加入酶切位点ＸｈｏⅠꎬ３'端加入酶切位点ＮｏｔⅠꎬ通过ＰＣＲ得到基因Ｐ１ꎮ１.２.２㊀表达载体ｐＰＩＣ９－Ｐ１的构建[８]分别对基因Ｐ１和质粒ｐＰＩＣ９进行ＸｈｏⅠ和ＮｏｔⅠ酶切ꎬ将回收后的Ｐ１和ｐＰＩＣ９按比例混合ꎬ用Ｔ４连接酶在１６ħ条件下连接过夜ꎬ连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ转化产物涂布在ＬＢ(含氨苄霉素)固体平板上ꎬ３７ħ倒置培养过夜ꎬ挑取单菌落至ＬＢ液体培养基ꎬ３７ħ培养ꎬ菌液进行菌落ＰＣＲꎬ电泳鉴定及测序验证ꎮ１.２.３㊀重组质粒转化毕赤酵母[８]抽提得到的重组质粒ｐＰＩＣ９－Ｐ１用ＳａｌⅠ进行单酶切ꎬ得到线性化质粒ꎮ取新鲜制备的(或－７０ħ冻存的)感受态细胞ꎮ电穿孔转化电击条件:１５００Ｖꎬ２００Ωꎬ２５μＦꎮ转化后的感受态细胞涂布ＭＤ培养基ꎬ１００μＬ/板ꎬ３０ħ倒置培养３－４天ꎬ在ＭＤ平板上筛选得到重组菌ꎬ经菌落ＰＣＲ得到目的序列ꎬ测序比对显示为目的基因Ｐ１的核苷酸序列ꎬ即所得菌株为含有ｐＰＩＣ９－Ｐ１的重组菌ꎬ命名为ＢＰ－１ꎬ用同样方法构建得到空质粒重组菌株ＢＰ－０ꎮ１.２.４㊀重组酵母菌的诱导表达将重组菌ＢＰ－１及ＢＰ－０ꎬ分别接种于装有３０ｍＬＢＭＧＹ培养基的２５０ｍＬ三角瓶中ꎬ３０ħꎬ２２０ｒ/ｍｉｎ培养至ＯＤ６００为１０左右ꎬ离心收集菌体ꎬ用３５ｍＬ的ＢＭＭＹ诱导培养基重悬菌体ꎬ并在３０ħꎬ２２０ｒ/ｍｉｎ条件下继续培养４８ｈꎬ过程中取发酵液离心后测定上清中的植酸酶酶活ꎬ并做ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行蛋白大小检测ꎮ１.２.５㊀植酸酶酶学性质钒钼酸铵法[９]进行测定ꎬ酶活力的定义:在温度３７ħ㊁ｐＨ５.５０条件下ꎬ每分钟从浓度为５.０ｍｍｏｌ/Ｌ植酸钠溶液中释放１μｍｏｌ无机磷所需的酶量为１个酶活单位(Ｕ)ꎮ１.２.５.１㊀最适作用ｐＨ及ｐＨ稳定性以ＢＰ－１发酵液上清液为样品ꎬ以测得的植酸酶最高酶活为１００％基准ꎬ在３７ħ条件下ꎬ分别在ｐＨ２.５－９的缓冲液中反应ꎬ测定不同ｐＨ条件下的酶活力ꎮ以ＢＰ－１发酵液上清液为样品ꎬ分别在ｐＨ２－９的缓冲液中处理３０ｍｉｎꎬ以测得的植酸酶最高酶活为１００％基准ꎬ对比相对酶活高低ꎮ１.２.５.２㊀最适作用温度及热稳定性以ＢＰ－１发酵液上清液为样品ꎬ以测得的植酸酶最高酶活为１００％基准ꎬ在ｐＨ５.０的缓冲液中ꎬ分别在３０ħ－９０ħ反应条件下测定酶活ꎬ计算相对酶活ꎮ以ＢＰ－１发酵液上清液为样品ꎬ以不作处理的植酸酶酶活为１００％基准ꎬ在ｐＨ５.０缓冲液条件下ꎬ样品分别在８０ħ－９５ħ下保温处理７０ｍｉｎꎬ每５－１０ｍｉｎ测定酶活ꎬ计算相对酶活ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀基因的获得通过ＰＣＲ得到目的基因ꎬ连接转化大肠杆菌ＤＨ５α后ꎬ进行菌落ＰＣＲꎬ琼脂糖凝胶电泳及测序对获得的目的基因进行验证ꎬ电泳结果如图１ꎬ大小与理论值１.１５ｋｂ基本一致ꎬ测序结果显示与原Ｐ－１基因一致ꎮ图１㊀基因Ｐ－１电泳图２.２㊀基因的表达及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析以ＢＰ－１发酵液上清进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ꎬ如图２ꎬ可以看出在４２ｋＤａ处有明显条带ꎬ与理论大小４１.９ｋＤａ一致ꎬ而含有空质粒的菌株并没有表达条带ꎬ说明基因Ｐ－１在毕赤酵母中成功分泌表达ꎮＭ:蛋白Ｍａｒｋｅｒꎬ０:毕赤酵母空质粒菌ꎬＰ－１:重组菌图２㊀ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白表达图２.３㊀酶活测定及酶的性质重组菌在ＢＭＭＹ培养基诱导表达后ꎬ对得到的ＢＰ－０及ＢＰ－１摇瓶发酵液上清进行酶活测定ꎬ测定结果对照空质粒菌株ＢＰ－０检测不到植酸酶活性ꎬ而重组菌ＢＰ－１在培养４８ｈ左右时植酸酶酶活为４５９Ｕ/ｍＬꎬ说明Ｐ－１基因在毕赤酵母中高效表达并分泌有活性的植酸酶ꎮ２.３.１㊀最适反应ｐＨ及ｐＨ稳定性图３㊀植酸酶最适反应ｐＨ图４㊀植酸酶ｐＨ稳定性按照１.３.５.１的方法对植酸酶最适作用ｐＨ进行检测ꎬ由图３结果可知ꎬ该植酸酶最适反应ｐＨ为５.０ꎮ而且该酶在ｐＨ４.０－８.５范围内的缓冲液中处理３０ｍｉｎꎬ相对酶活仍剩余８０％以上(图４)ꎬ说明该植酸酶耐酸碱性良好ꎬ具有较好的化学稳定性ꎬ适于动物的偏酸性消化道环境ꎮ２.３.２㊀最适反应温度及热稳定性在ｐＨ５.０的缓冲液中ꎬ分别在３０ħ－９０ħ条件下测定酶活ꎬ计算相对酶活ꎬ结果如图５所示ꎬＢＰ－１所产植酸酶最适作用温度为７０ħꎮ图５㊀植酸酶最适反应温度图６中可以看出ꎬ８０ħ保温处理７０ｍｉｎ后ꎬ该酶相对活性剩余８４％以上ꎬ９０ħ处理３０ｍｉｎ时ꎬ酶活仍存留８０％以上ꎬ９５ħ处理５０ｍｉｎ后酶活损失小于５０％ꎬ说明该重组菌ＢＰ－１所产植酸酶具有良好的耐热性ꎬ在食品加工㊁饲料造粒等过程中都需要热处理ꎬ而植酸酶作为添加剂在这个过程中损失较大[１０]ꎬ耐热性良好的植酸酶就能有效缓解这一问题ꎮ图６㊀植酸酶热稳定性结果３㊀结㊀论本研究将来源于地衣芽孢杆菌的植酸酶基因在毕赤酵母中成功表达ꎬ得到重组菌ＢＰ－１ꎬ该重组菌在ＢＭＭＹ培养基摇瓶诱导表达植酸酶酶活就达到４５９Ｕ/ｍＬꎬ接下来的工作中ꎬ在本公司原来的工艺优化基础上[１１]ꎬ对该重组菌进一步放大试验ꎬ进而实现植酸酶大规模生产ꎬ且ＢＰ－１所产植酸酶热稳定性良好ꎬ８０ħ处理７０ｍｉｎꎬ相对酶活仍剩余８０％ꎬ８０－９５ħ范围内处理２０ｍｉｎ时ꎬ酶活剩余都在８０％以上ꎬ９５ħ处理５０ｍｉｎ后酶活损失小于５０％ꎬ并具有较广泛的ｐＨ适应性ꎬ这些性质对于其在食品加工㊁饲料造粒等的应用中具有重要作用ꎮ参考文献[１]Ｒｏｃｋｙ－ＳａｌｉｍｉＫꎬＨａｓｈｅｍｉＭꎬＳａｆａｒｉＭꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｐｈｙｔａｓｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｐＨｔｏｌｅｒａｎｃｅｆｒｏｍｒｉｃｅｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ￣ｌｉｓＢ.Ｓ.４６[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１６ꎬ７(３):３８１－３９０.[２]王红艳ꎬ王云飞ꎬ王申涛.植酸酶的研究进展及应用[Ｊ].中国酿造ꎬ２０１０ꎬ２９(４):２４－２５.[３]马永强ꎬ程文红ꎬ那治国ꎬ等.植酸酶在米糠谷蛋白提取中应用的研究[Ｊ].食品工业科技ꎬ２０１６ꎬ３７(１０):１８９－１９３.[４]ＲｉｍｂａｃｈＧꎬＷａｌｔｅｒＡꎬＭｏｓｔＥꎬＰａｌｌａｕｆＪ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉ￣ｃｒｏｂｉａｌｐｈｙｔａｓｅｏｎｚｉｎｃｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙａｎｄｃａｄｍｉｕｍａｎｄｌｅａｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｇｒｏｗｉｎｇｒａｔｓ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍＴｏｘｉ￣ｃｏｌꎬ１９９８ꎬ３６:７－１２.[５]李秀珍ꎬ刘同军ꎬ杨平平ꎬ等.植酸酶在食品和医药方面的应用展望[Ｊ].中国酿造ꎬ２００６ꎬ２５(１２):９－１２.[６]黄魁英ꎬ夏枫耿ꎬ黄乐天ꎬ等.耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌发酵中试条件优化[Ｊ].现代食品科技ꎬ２０１１ꎬ２７(１０):１２３８－１２４１.[７]吴秀秀ꎬ王华明.植酸酶突变体ꎬＣＮ１０５６２４１３１Ａ[Ｐ].２０１６.[８]Ａ.Ｓ.梅利克ꎬＬ.罗杰斯ꎬ梅利克ꎬ等.分子生物学实验参考手册[Ｍ].化学工业出版社ꎬ２００９.[９]洒荣波ꎬ唐瑜菁.发酵液中植酸酶活性测定方法的研究[Ｊ].中国酿造ꎬ２０１０ꎬ２９(４):１６７－１６９.[１０]李富伟ꎬ汤海鸥ꎬ汪勇.耐高温植酸酶生产技术研究进展[Ｊ].饲料工业ꎬ２００８ꎬ２９(１６):１７－１８.[１１]王兴吉ꎬ盛花开ꎬ张杰.产耐热植酸酶重组毕赤酵母发酵条件优化的研究[Ｊ].中国饲料添加剂ꎬ２０１５(１１):１６－１８.。

张智，温冬灼，冯丽荣，等. 耐热解淀粉芽孢杆菌BA-DES4产纤维素酶的分离纯化及酶学性质[J]. 食品工业科技，2023，44（11）：136−143. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070337ZHANG Zhi, WEN Dongzhuo, FENG Lirong, et al. Separation, Purification and Enzymatic Property of Cellulase Produced by Thermostable Bacillus amyloliquefaciens BA-DES4[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(11): 136−143. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070337· 生物工程 ·耐热解淀粉芽孢杆菌BA-DES4产纤维素酶的分离纯化及酶学性质张　智1，温冬灼1，冯丽荣2，章圣龙2，杨可心1，张晓彤1（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江国宏节能环保有限公司，黑龙江哈尔滨 150040）摘　要：目的：本研究以一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌BA-DES4为材料，纯化并研究了其纤维素酶的酶学性质。

方法：研究采用硫酸铵分级沉淀及SephadexG-75凝胶过滤层析方式对其所产纤维素酶进行分离纯化，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）确定其分子量，并对纯化后纤维素酶的酶液进行酶学性质研究。

结果表明：发酵液中分离纯化获得纤维素酶系组分（内切葡聚糖酶），对纯化的电泳内切葡聚糖酶进行酶活测定，其比活力为51.08 U/mg 。

发现其分子量为22.4 kDa ；初步酶学性质研究表明：该酶的最适反应温度和最适pH 分别为65 ℃和6.0，且在pH5.0~7.0和温度55~65 ℃下稳定性较高；Mn 2+对纤维素酶活力激活作用较为显著，Cu 2+的抑制作用最大。

植酸酶耐热性评价方法的研究制粒对植酸酶活性的影响一直是限制植酸酶进一步推广应用的重要因素,针对这一问题,目前解决的方法有提高植酸酶添加量、包被技术、采用液体植酸酶制粒后喷涂技术、通过微生物菌株遗传改良开发耐高温植酸酶产品等。

不管是哪种途径,制粒对植酸酶活性的影响是不可避免的,有效评价制粒过程中植酸酶活性的损失具有重要的应用价值。

研究旨在系统比较水浴法、干热法和湿热法在评价植酸酶耐热性的效果,并比较同一温度条件下水浴法、干热法和湿热法测定结果与实际调质和制粒加工处理条件下的测定结果,来筛选相对科学、更能反映实际调质和制粒对植酸酶活性影响的实验室评价方法。

1 材料与方法1. 1 试验材料试验用植酸酶A、B、C来源于目前市场上具有代表性的产品,其中植酸酶A来源于真菌;植酸酶B来源于细菌;而植酸酶C来源于真菌,但经过了包被处理。

1. 2 试验方法水浴法:正确称取酶样品0. 8 g,转移到100 mL容量瓶中,用含有吐温-20的乙酸缓冲溶液定容至100 mL,提取45 min。

待溶解混合完成后,分别取3个10 mL离心管,分别取1 mL上述溶液转移到离心管中,再用含有吐温-20的乙酸缓冲溶液定容至10 mL,分别置于70, 80, 90e水浴锅加热10 min(5 min预热, 5 min加热处理),取出用于测定高温处理后溶液中植酸酶活性。

干热法:用称量瓶(30mm@50mm)分别称取2 g植酸酶A、B、C样品,置于70, 80, 90e恒温烘箱中处理10 min(其中前5 min为预热期),取出冷却后备用。

湿热法:先测定各种植酸酶样品中水分含量,用称量瓶(30mm@50mm)分别称取2 g植酸酶A、B、C样品,根据植酸酶样品中水分含量并通过添加纯化水的方法调节待处理植酸酶样品中水分至16% (模拟实际调质和制粒时配合饲料通入蒸汽后湿度),置于70, 80, 90e恒温烘箱中处理10min(其中前5min为预热期),取出冷却。