高效石油降解菌的筛选及初步鉴定

山东轻工业学院2012届本科生毕业论文目录摘要············································································································ - 3 -ABSTRACT ······································································································ - 4 -第一章绪论··································································································· - 5 -1.1．微生物提高采收率的研究状况······················································ - 5 -1.1.1．方法的提出··········································································· - 5 -1.1.2．国内研究现状[1] ··································································· - 6 -1.1.3．国外研究现状······································································· - 6 -1.2．微生物采油的机理及条件······························································ - 7 -1.2.1．微生物采油方法的机理······················································· - 7 -1.2.2.微生物采油的条件·································································· - 8 -1.2.2.1.菌种的选择··········································································· - 8 -1.2.2.2.油藏的条件··········································································· - 8 -1.3.常用的MEOR方法··········································································· - 9 -1.3.1．应用微生物表面活性剂助采··············································· - 9 -1.3.1.1.生物表面活性剂··································································· - 9 -1.3.1.2.生物表面活性剂在石油工业中的应用······························· - 9 -1.3.2．生产井周期性微生物处理··················································· - 9 -1.3.3．微生物注水········································································· - 10 -1.3.4．活化油层内源有微生物群落············································· - 10 -1.4．微生物采油的优势与不足···························································· - 10 -1.5．本论文的研究内容········································································ - 10 -第二章原油降解假单胞菌的分离筛选与鉴定········································· - 11 -2．1．菌种筛选····················································································· - 11 -2．1．1．材料··············································································· - 11 -2．1．2．方法··············································································· - 11 -2．1．3．结果与讨论··································································· - 12 -2．2．菌种鉴定····················································································· - 12 -2．2．1．材料··············································································· - 12 -2．2．1．1．菌株········································································· - 12 -2．2．1．2．培养基····································································· - 12 -2．2．1．3．试剂配制································································· - 13 -2．2．2．鉴定方法······································································· - 14 -2．2．3．结果与讨论··································································· - 17 -2．3．本章小结····················································································· - 21 -第三章各假单胞菌株降油性能的初步研究············································· - 22 -3．1．材料····························································································· - 22 -3．1．1．菌株··············································································· - 22 -3．1．2．培养基··········································································· - 22 -3．2．方法····························································································· - 22 -3．3．结果与讨论················································································· - 23 -- 1 -山东轻工业学院2012届本科生毕业论文3．4．本章小结····················································································· - 25 -参考文献········································································································· - 25 -- 2 -山东轻工业学院2012届本科生毕业论文- 3 - 摘 要微生物采油是技术含量较高的一种提高采收率技术，包括微生物在油层中的生长、繁殖和代谢等生物化学过程，还包括微生物菌体、微生物营养液、微生物代谢产物在油层中的运移，以及与岩石、油、气、水的相互作用引起的岩石、油、气、水物性的改变。

2020年02月Bi 、Ni 、Fe 、Mn 、Ca 、Mg 、Al 、Cu 、Pt 、Pd 标准溶液0、0.50、1.00、5.00、10.00ml 于100ml 容量瓶中，分别加入10ml 王水，用去离子水定容至刻度摇匀以备用；此系列混合标准溶液为0、0.5、1、5、10µg/ml （个别含量高的元素可准备为50µg/ml 的高标）。

（3）样品的测定。

将上述保留的分金溶液及洗液蒸发至近干，用王水加热溶解，冷至室温定容至刻度线，混匀静置待测。

采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES ）在相应的波长下测定铋、铅、铜、铁、砷、蹄、镍、镉、猛、钙、镁、铝、铂、钯的浓度，仪器需优化消除干扰以获得最大的灵敏度，使谱线强度和浓度成线性关系。

将所有元素的测定值减去空白值相加来计算分金溶液和洗液中的总杂质含量。

3结果3.1金银合粒中存在的杂质元素根据铜精矿元素情况，其中主要金属元素含有铜、铁、钙、镁、铝、铋、铅、砷、蹄、镍、镉、猛、铂、钯等14种元素，通过火试金分离富集得到的金银合粒除去了大多数杂质元素，其主要成分为金银，其余杂质成分含有少量的铅、铋、钙，部分样品含有少量的铂、钯[1]。

本文列举了几种有代表性的铜精矿分析各元素含量可知6类样品金银合粒中铜、铁、砷、蹄、镍、锰、镉、镁、铝的含量均＜0.2ug,其含量基本忽略不计，而所有铜精矿金银合粒中均含有铅、铋、钙这三种元素，含量随品位高低有波动，有2类铜精矿金银合粒中测出少量的铂、钯。

3.2方法精密度和样品回收率试验金银合粒中存在的杂质元素主要是铅、铋、钙、铂、钯，选择铜精矿样品，经火试金富集、分金酸溶解后按所选仪器最佳工作条件测定，考察方法的精密度和样品加标回收率（n=8）如见表2。

表2部分元素精密度和加标回收率元素Pb Bi Ca平均值/ug 30.2063.253.75RSD/%3.582.695.25加入量/ug 20.0050.003.00回收总量/ug49.90110.906.90回收率%99.40%97.92%102.22%3.3杂质元素对银品位影响准确测定各类铜精矿金银合粒中的杂质元素总含量，分析换算成品位的影响情况，通过统计数据得知大部分铜精矿金银合粒中杂质品位占比在0.5~4.5%，随着银品位升高杂质占比减少。

高效石油烃降解菌的筛选及其初步分类鉴定近年来，随着石油化学品的大量应用，一些污染物已经成为人们关注的焦点。

石油烃，作为最常见的污染物，被投入环境会极大地破坏生态环境。

因此，研究降解石油烃的微生物成为当今社会的热门研究方向。

筛选到的高效石油烃降解菌可以用来处理污染的环境，以改善环境质量。

石油烃降解菌分为两类：一类是完全降解石油烃的菌，另一类是部分降解石油烃的菌。

完全降解的菌能够将石油烃分解成水、碳氢氧化合物和硫化物；而部分降解的菌仅能将石油烃分解成部分组分，或者将高分子物质分解成低分子物质。

石油烃降解菌的筛选和鉴定，是基于菌类的鉴定和解析，从而获取具有降解功能的微生物菌株。

石油烃降解菌的筛选及其初步分类鉴定，一般采用具体的技术方法，如PCR、测序、RT-PCR、存量分析技术、液相色谱法和质谱法等，以实现微生物的细菌鉴定。

首先，根据细菌的培养条件选择表征对象；其次，使用PCR和测序技术获取基因组序列；接着，采用多元结构基因序列的聚类分析技术，将菌株划分到不同的分类单元中；然后，使用RT-PCR方法以及液相色谱法和质谱法等技术，进一步分析基因序列及其编码蛋白质的结构和功能，以确定菌株具有高效石油烃降解功能。

除了上述技术之外，还可以采用其他的实验方法。

例如，可以采用生态学的方法来筛选石油烃降解菌，例如分子系统发育聚类分析、共生小组测定，以及祖先和进化形态特征等方法，以获得降解功能菌株。

此外，还可以采用分子模拟法，预测石油烃降解菌的蛋白质结构和功能，以及识别有效的降解活性酶。

综上所述，石油烃降解菌的筛选及其初步分类鉴定，其实质是一项复杂的系统生物学研究，需要借助于先进的生物技术，以确定具有有效降解石油烃的微生物菌株。

任何一种分类鉴定方法都不可能完全准确，因此，最佳方法是将多种技术结合起来，以发掘具有高效降解石油烃能力的菌株。

该研究所获得的结果，将为后续石油烃污染的治理提供有力支持，可能会改善环境质量，保护生态环境，为建设良好的生态环境起到重要作用。

42工业安全与环保2013年第39卷第2期I ndust r i al Saf et y a nd Envi r onm e nt alPr o t ect i onFebr uary 2013高效石油降解菌的筛选、鉴定及其配比优化的研究*王旭辉晁群芳徐鑫李磊(新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046)摘要从克拉玛依地区石油污染土壤中分离筛选出4株高效石油降解菌S 1、S 2、S5和s 8，经形态观察、生理生化反应和分子鉴定，确定4株菌分别为蜡样芽孢杆菌(Baci l l us cel ℃us )、恶臭假单胞菌(Ps eudom onaspLni ．da)、枯草芽孢杆菌(B aci ll us s ubf i l is )和地衣芽孢杆菌(B aci l lus l i eheni f oi m i s)。

为了提高对石油的降解效率，对4株菌的添加比例进行了响应面的优化。

结果表明，当石油含量为1．5g 时，菌种s1、S2、s5和s8接种量分别为0．21g,O ．22g ．0．41g 和0．22g 时的石油降解率达到最大值。

在该条件下石油降解率预测值为60．17％，验证值为60．10％。

关键词降解率筛选菌种鉴定响应面法石油污染St udyont he I s ol at i on and I den t i f i cat i on of Pet rol eum —-D egradi ngSt r ai nsandIt s R at i o O pt i m i za t i onW A N G Xuh ui C H A O Q anf 锄培X U X i nLIL e i(Col l egeof 啦Sci enceandTechnology ，Xinjio 曙Unim=豇y 蛳830046)A bs W actFou rst r ai ns (S1，S2，S5，S8)，w i t hgood abi li t y ofde g 丑di ng oil ，aIe i sol at ed f rom oi l —c ont ami nat i on s oil ofK ar a-m a yar eas ．Base do nm or phol ogi c obs er vat i on ，physi o l ogi c al a nd bi oc he mi ca l cha r act e r i st i cs ，m o l ecul ar i dent i f i cat i on ，t hey a_r ei dent i f i edasB aci l l us ce r eus ，B a ci l l u s l i ch eni f onni s ，B aci l l us s ub t i li s a ndPs eudom onas 叫dar espe ct i vel y ．I n or de r t o i m -pr ovet he ef l ％i ency of t he de gr ada t i o n ．t h e r ati o of f our s t l ai as i s opt i m i ze d by us i ng r e s pons e suI f i c e m et hodol ogy ．T he r esul ts how s t hat t he opt i m um con di t i o ns al easfol l ow s ：w hen t he oi lco nt enti s 1．5g a nd t he i nocul a t i on quant i t y of t he f o ur st r ai m(S1，眈，s5，S8)i s0．21g ，0．22g ，0．41g ，0．22g ，r espect i vel y ，t he r at e of oi l de gr a da t i onPA t hr e ac h t hem s ．x 抽um ．U ndert he se cond i t i ons ，t he pr e di ct i ve va l ue of oil de gr ada t i on i s 60．17％，m e a nw hi l e t he ver i f i cat i on va l ue is 60．10％．K eyW or dsde ge ner at i on r at ei sol at i onst rai m i dent i fi cat i onre s pons e sur f ac e met hod ol og y oi l —c ont am i nat i on0引言随着工业的发展，石油及其制品通过开采与运输过程的泄漏、污染水灌溉及大气飘尘的沉降等途径进入了环境，对土壤和水体造成严重的污染。

大庆油污土壤中石油降解菌的筛选和鉴定研究大庆油田是我国最大的陆上油田，其丰富的石油资源为我国的石油工业发展作出了重要贡献。

与石油生产相关的油污问题也给环境和生态造成了一定的影响。

油污土壤中的石油降解菌是生物修复技术的重要组成部分，对于油田环境的恢复和保护具有重要意义。

本文旨在对大庆油污土壤中的石油降解菌进行筛选和鉴定研究，以期为该地区的生物修复技术提供理论和技术支持。

一、研究背景和意义大庆油田自1959年投入生产以来，已经产出了数十亿吨的原油，但同时也造成了大量的油污土壤。

传统的土壤修复方法通常是采用化学物质进行处理，但这种方法对环境的影响和破坏性较大。

相比之下，生物修复技术由于其绿色环保、成本低廉的特点，受到了越来越多的重视。

在生物修复技术中，石油降解菌是至关重要的。

石油降解菌能够利用石油中的碳源和能源进行代谢，分解有机化合物，将其转化为无害的物质，从而加速土壤中石油的降解和分解过程。

对于油污土壤中存在的石油降解菌进行筛选和鉴定，有助于选择出高效的菌株，并进一步应用于生物修复工作中。

研究大庆油污土壤中石油降解菌的筛选和鉴定，也可以为该地区的环境保护工作提供理论和技术支持。

通过对菌株的鉴定和特性分析，可以掌握地方石油降解菌的多样性和功能特点，为该地区的生物修复应用提供有力的支持。

二、研究方法和步骤1. 样品采集本研究选取大庆油田附近的油污土壤为研究对象，通过系统的样品采集和分析，确定石油降解菌的种类和数量分布情况。

2. 培养和筛选将采集的土壤样品进行菌落计数和分离培养，筛选出优良的石油降解菌菌株。

通过对菌株的形态特征、培养条件和生理生化指标等进行初步鉴定，选取具有较高石油降解活性的菌株进行后续的研究。

3. 生物学特性分析对筛选出的石油降解菌菌株进行进一步的生物学特性分析，包括对菌株的生长速率、代谢产物、抗性能力等进行测定和分析，以确定其在生物修复工作中的应用潜力。

4. 分子生物学鉴定通过16S rRNA序列分析等分子生物学方法，对筛选出的石油降解菌菌株进行进一步的鉴定，确定其系统发育位置和亲缘关系。

不同来源石油降解细菌的筛选鉴定【摘要】从江苏油田的原油和四种不同来源的土壤中，用三种不同的培养液筛选得到41株细菌。

对具有较强降解能力细菌的其中8株菌进行测序鉴定，初步确定属于芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、食碱杆菌属及无色杆菌属。

【关键词】石油；降解；细菌石油及其加工品进入土壤，造成土壤的石油污染。

微生物修复具有处理效果好，污染物残留量低，不产生二次污染，对环境影响很小，能够保持或改善植物生长的土壤环境等优点[1]。

向污染土壤中投加环境适应性强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油类污染物降解效率的重要手段[2]。

1.材料与方法1.1菌种来源（1）土样：江苏真武石油基地。

①132#磕头机（久置未用）旁表层土；②185#磕头机（长期使用）旁表层土；③磕头机附近草地草根土；④计量站旁表层油污土。

（2）原油：江苏真武石油基地。

1.2富集培养基（1）无机盐培养液（g/L）：NaNO32，K2HPO41，K2HPO4·3H2O0.5，NaCl0.5，MgSO4·7H2O0.1，CaCl20.01，FeSO4·7H2O0.01PH=7，石油烃（原油：柴油体积比1：4）1%（2）牛肉膏蛋白胨培养液（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，PH=7，石油烃0.5%（3）牛肉膏蛋白胨培养液，石油烃0.5%，表面活性剂50mg/L1.3石油中细菌的培养分离牛肉膏蛋白胨培养基冷却后，加入1%的原油混匀，倒平板。

恒温培养箱中30℃静置培养。

待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，划线纯化，将纯化菌株于试管斜面培养后于冰箱4℃保存。

三个重复。

1.4土壤中石油烃降解菌的筛选称取10g土样加入到装有100mL富集培养液的三角瓶中。

30℃振荡培养7天。

静置30min，取10mL上清夜转接入新鲜培养液中。

重复上述步骤连续富集培养5次。

富集培养后，取菌液1mL梯度稀释成10-6、10-7、10-8，取三种不同稀释度菌液0.1mL涂布于分离培养基平板上，28℃恒温培养；待平板长出菌落后选择不同颜色及形态的单菌落，划线纯化，将纯化菌株于试管斜面培养后于冰箱4℃保存。

高效石油降解细菌的筛选鉴定和菌群构建的开题报告
1. 研究背景和意义
石油是全球最重要的能源之一，其产生的污染也成为全球关注的环境问题之一。

由于石油分子结构复杂，难以被自然降解，导致石油泄漏或排放造成的环境污染难以
治理。

因此，通过利用高效石油降解细菌来处理石油污染已成为一种重要的治理方式。

本研究致力于筛选鉴定优良的高效石油降解细菌，并构建一个高效的石油降解菌群，
提高石油污染环境治理的效率。

2. 研究内容和方案
本研究计划采取以下方案开展实验研究：
（1）筛选土壤中的高效石油降解细菌：收集石油污染的土样，通过营养富集法
和菌落计数法筛选优良的石油降解菌，并鉴定其分类学特征。

（2）优化石油降解条件：根据石油降解细菌的特性，探究其最适宜的生长条件，包括温度、pH值、营养物质等，同时选择较难降解的石油组分进行优化处理。

（3）构建石油降解细菌菌群：根据石油降解能力和生态适应性，挑选适合组成
菌群的石油降解细菌，搭配不同生态位的细菌共同组成菌群，提高石油降解效率和生
态稳定性。

（4）菌群构建的评价和验证：通过实验室模拟和现场应用等方法，验证构建的
菌群石油降解能力和生态适应性。

3. 研究意义和创新点
本研究的意义在于筛选鉴定高效石油降解细菌，并构建出具有高效降解能力和较好生态稳定性的石油降解菌群，为石油污染环境治理提供一种可行的方式。

同时，本
研究将针对不同生态位的石油降解细菌进行合理组合，提高石油降解处理的效率和生
态稳定性，具有一定的创新点。