下载文档原格式
卵黄抗体的制备方法
1、选择健康、产蛋率高的蛋鸡，购进后饲养1周左右，观察其健康情况。
2、采用多种抗原进行免疫，如灭活的病原体、激素类、蛋白类物质等，使用前可以选用弗氏完全佐剂乳化抗原。
3、采用不同的免疫方式，如肌肉注射、腹腔注射、皮下注射等，并设定合适的免疫剂量和免疫次数。
4、使用琼脂免疫扩散实验检测免疫鸡血清中的抗体效价，效价达到1:64以上时，可开始收集免疫蛋鸡所产鸡蛋。
5、收集卵黄抗体，先用清洁水洗去蛋壳表面的粪污，再使用碘酊和酒精消毒。
无菌条件下打开胚壳，倾出蛋黄至灭菌大烧杯中，以1:9的比例加入灭菌生理盐水或0.01 mol/L pH7.2的PBS稀释并充分混匀，调节pH至5.2。
6、对卵黄抗体进行纯化，可采用硫酸铵沉淀法、PEG沉淀法等方法进行纯化。
高免卵黄抗体的制备与应用的注意事项高免卵黄抗体在医学研究和诊断中具有广泛的应用。
制备和应用这些抗体需要遵循一些重要的注意事项，以确保其质量和有效性。
以下是有关高免卵黄抗体的制备和应用的50条注意事项：1. 在开始前，确保已获得适当的伦理批准和许可证。
2. 确保使用健康的动物作为抗体生产的源头。
3. 使用合适的免疫佐剂来增强动物的免疫反应。
4. 避免使用过多的佐剂，以防止对动物免疫系统的不良影响。
5. 需要对动物进行充分的疫苗接种来激发免疫反应。
6. 在制备抗体的过程中需要充足的光照和良好的通风条件。
7. 保持动物舒适，提供足够的饮食和水源。
8. 在制备的过程中避免动物暴露于可能引起感染的环境。
9. 定期监测动物的健康状况，并在必要时进行治疗。
10. 使用可靠的免疫检测方法来监测抗体的产生。
11. 建立严格的动物记录，以跟踪抗体生产的动态。
12. 在抗体制备的过程中进行周期性的动物背景检查，以确保细胞株的纯度和稳定性。
13. 遵循良好的实验室实践，以确保实验结果的准确性和可重复性。
14. 使用合适的方法和试剂来分离和纯化抗体。
15. 避免不必要的抗菌药物使用，以避免对抗体产生影响。
16. 示例处理时避免冻融循环。
17. 存储抗体的过程中需要注意温度和湿度。
18. 根据实际需要将抗体储存为合适的浓度和容量。
19. 避免抗体遭受不必要的震荡或振动。
20. 对抗体进行定期的质量检查和测试。
21. 在使用抗体之前，确保其对目标分子具有特异性和亲和力。
22. 选择适当的方法和实验条件来检测抗体与靶分子的结合。
23. 遵循正确的实验步骤和实验设计来保证结果的准确性。
24. 使用适当的阴性和阳性对照来评估抗体的反应性。
25. 需要在适当的实验条件下进行抗体活性和稳定性的评估。
26. 在应用抗体之前，了解其最佳工作浓度和条件。
27. 优化实验条件以达到最佳的抗体-靶分子结合。
28. 在实验中使用适当的负对照来排除非特异性反应。
如何制作应用卵黄抗体(鸡新城疫)卵黄抗体是治疗鸡新城疫（ND）和传染性法氏囊病（IBD）的一种特效药，于20世纪90年代，利用免疫学理论研究生产的新药，具有特异性诊断、治疗和预防作用。
目前，已广泛应用于鸡新城疫和传染性法氏囊病的防治上，均收到了良好效果。
制作方法将新城疫I系苗、传染性法氏囊强毒苗连续注射健康无病产蛋鸡三次，第一次1个免疫量，第二次2个免疫量，第三次3个免疫量。
待3周后收集母鸡所产的蛋，无菌采取蛋黄，加灭菌生理盐水稀释成1∶20的混悬液，测定效价，加入抑菌剂，然后进行分装，在0℃以下保存备用。
卵黄抗体成分与效价卵黄抗体也称母源抗体、IgG抗体。
是母体血液中小分子抗体IgG通过胎盘、输卵管、滋养层传给后代。
保存入卵的蛋黄中，若孵化出鸡雏，则对新城疫、传染性法氏囊有特异的抵抗作用。
这种抵抗作用称为抗体，其分子结构称为单体Ig，由2条多肽重链和2条多肽轻链组成。
沉淀系数7S，分子量160000-180000，含糖2.5%。
现已发现有四种IgGT型重链同种异型，也称作四个亚型并含硫的半胱氨酸。
具有抗感染、抗菌、抗病毒作用。
由于氨基酸排列顺序具有高度可变性，能接触到抗原的物质，并发生特异结合，产生中和作用，从而体现特异作用。
卵黄抗体好与否的标准是用HA和HI试验测定的稀释倍数，称为效价，Iog2的指数越大，效价越高，通常把1∶64效价称为高免卵黄抗体，其半衰期为4天左右，因此，用卵黄抗体替代主动免疫时间在2周~4周，应科学选择使用日期，注意半衰期，计算保护期，当降到临界线时，应及时补充。
卵黄抗体的作用诊断作用：卵黄抗体具有沉淀素的特性，当诊断时，若怀疑鸡群发生传染性法氏囊病，可采取病料5克，加灭菌生理盐水10毫升，研磨，加抗菌剂抑菌，置于冰箱过夜，作为未知抗原，制作备用琼脂板，打成梅花状七孔后，同时加入未知病料抗原和已知的卵黄抗体各一份，约0.5毫升，25℃放置24小时~72小时，出现肉眼可见白色沉淀线，为阳性反应。
抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备、活性评价及其应用研究由于甲型流感病毒变异快、抗甲流病毒的化学药物毒副作用大,易产生耐药性,同时有效疫苗的制备难度很大,因此寻找一种安全、简便、高效的甲型流感防治药物成为目前具有挑战性的研究课题。
卵黄抗体(Egg yolk immunoglobulin, IgY)具有来源广、特异性好、安全无残留、性能稳定及价格合理等优点,在病毒性疾病的预防、治疗和诊断方面具有广阔的应用前景。
本课题采用灭活甲型流感病毒为抗原免疫产蛋鸡,制备特异性IgY,对IgY的体内外抗病毒活性及其在甲型流感病毒检测中的应用进行研究,为特异性IgY在甲型流感的预防、治疗及检测方面的应用提供理论依据。
研究内容分为四部分：1抗甲型流感病毒卵黄抗体的制备1.1以灭活甲型H1N1流感病毒A/广东/732/2009(H1N1)pdm09和A/加利福尼亚州/7/2009(H1N1)pdm09毒株及季节性甲型流感病毒A/广东/622/2009(H1 N1)和A/广东/749/2009(H3N2)毒株为抗原分别免疫蛋鸡获得特异性IgY。
采用PEG沉淀法得到IgY纯度95.80%,回收率93.01%。
1.2经ELISA检测,不同抗原免疫产生的抗体效价随时间的变化趋势基本一致,1 mg/mL的IgY的最高效价达3200,最高效价在卵黄中可持续6周,高效价抗体(>2500)在卵黄中可持续10周以上。
2抗甲型H1N1流感病毒卵黄抗体的体外活性评价主要对抗甲型H1N1流感病毒A／广东/732/09(H1N1)pdm09 IgY的抗病毒活性进行了分子水平和细胞水平上的评价。
2.1琼脂扩散和荧光免疫实验,结果表明IgY能与病毒颗粒结合并使其产生沉淀；Western Blot分析和HI实验,结果显示IgY能与病毒表面的主要膜蛋白神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)及基质蛋白(M)发生特异性结合,能有效抑制病毒对红细胞的凝集作用,1.0mg/mL的IgY能完全抑制红细胞凝集的最高稀释倍数为128。
【关键词】卵黄囊抗体卵黄囊抗体即卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin，IgY)是抗原免疫禽类后由卵黄中分离得到的特异性抗体。
与哺乳动物来源的IgG比较，卵黄囊抗体具有取材方便、分离纯化方法简单、产量高，同时具有特异性高、稳定性较好等优点，在疾病诊断、防治等诸多方面得到了广泛的应用，一直是生命科学相关科研领域的研究热点。
本文就卵黄囊抗体的分离纯化方法及其应用研究进展作一综述。
1 卵黄囊抗体的基本结构及其性质与哺乳动物血清免疫球蛋白相似，卵黄囊抗体的基本结构包括2条轻链和2条重链，分子量约为180kD。
卵黄囊抗体的疏水性大于IgG。
Lee和Kim等〔1,2〕研究表明，卵黄囊抗体具有良好的稳定性，对pH及酶等作用引起的失活效应有较强的抵抗力。
2 卵黄囊抗体的制备21 实验动物的免疫 Schwarzkopf等〔3〕研究结果表明：经皮下注射的方法比肌肉注射能产生更高滴度的抗体，免疫间隔时间对抗体的产生影响较大。
通常，初次免疫与第一次加强免疫之间的时间间隔至少4周。
另有研究分别于第0d，10周及15周免疫产蛋鸡，获得了高达1∶160000的抗体滴度。
22 卵黄囊抗体的分离从卵黄液中分离卵黄囊抗体的关键是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分(Water Soluble Fraction，WSF)。
根据纯度要求、技术工艺以及对环境的影响等因素，可以选择不同的分离方法。
常见分离方法包括以下几种。
221 水稀释法先将卵黄液用蒸馏水稀释10倍，调整pH值至50～52，4℃静置6h以上，上清液即为水溶性组分。
水稀释法工艺简单，若采用适当的方法进行纯化，可获得较高的回收率和纯度。
222 有机物沉淀法聚乙二醇(PEG)法是较常用的方法。
Bizanov和Normantiene〔4〕用仙台病毒免疫产蛋母鸡，收获高免鸡蛋。
以TBS作为缓冲液，将卵黄液稀释4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂类，卵黄囊抗体保留在上清液中。
卵黄抗体的提纯及应用
卵黄抗体是一种针对鸡蛋卵黄中的蛋白质进行识别和结合的抗体。
由于鸡蛋卵黄含有大量蛋白质和营养成分，因此卵黄抗体被广泛应用于生物学、医学和食品科技领域等。
卵黄抗体的提纯方法主要包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析等多种技术。
其中，离子交换层析是最常用的技术之一。
该技术的步骤包括：将混合溶液加到已经平衡好的离子交换层析柱中，洗脱非特异性吸附物质，然后用适当的洗液洗脱目标蛋白质。
凝胶过滤是用孔径大小分列的凝胶包装柱，通过洗涤和吸脱的方式，将目标蛋白质从其他混杂物中分离出来。
亲和柱层析则是通过将特定的亲和剂固定在某种无机或有机材料上，制成柱后，再利用亲和剂与目标物质的特异性结合，从而将目标物分离出来。
这种方法利用目标物质与亲和剂之间的特定相互作用使其分离，可以保持目标物质的天然构象，纯度相对较高。
卵黄抗体作为一种重要的实验工具，被广泛应用于生物学、医学和食品科技等领域。
在生物学中，卵黄抗体可用于免疫印迹实验、免疫沉淀实验、流式细胞术、免疫组织化学等多种实验。
在医学中，卵黄抗体可以用于诊断和治疗某些疾病，如肿瘤、心血管疾病等。
在食品科技领域，卵黄抗体可以用来检测食品中的蛋白质含量和质量，也可以用于检测食品中的某些成分。
总之，卵黄抗体具有广泛的应用价值。
通过合适的提纯方法，可以获得高纯度的卵黄抗体，从而更好地发挥其应用价值。
抗鸡球虫卵黄抗体制备及初步应用作者：钱玮霖指导老师：徐前明（安徽农业大学植保学院合肥 230061）摘要：本项目旨在研制抗鸡球虫卵黄抗体，为防治鸡球虫病提供一种新的手段。
利用对临床所分离的球虫，经超声波裂解制备粗抗原，然后将所得抗原分别于弗氏完全佐剂和不完全佐剂混合，经肌肉注射方式对鸡蛋进行免疫，收集免疫后的卵黄；采用饱和硫酸铵法分离卵黄中的抗体，并用聚乙二醇浓缩获得较高浓度的抗体；采用凝集试验确定其抗体水平，并采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法进行抗体纯度分析；最后将所分离的抗鸡球虫卵黄抗体用于鸡感染球虫保护试验。
结果表明：（1）临床所分离得球虫多为混合感染，达3种以上；（2）蛋鸡经免疫后，经凝集试验可证实其抗体水平可达1:28，SDS-PAGE电泳显示：纯化后抗体大小为67.0kD 和23kD，且纯度较高。
基于上述情况，认为本试验制备出抗鸡球虫卵黄抗体方法并初步阐明了其抗鸡球虫的基本功能。
关键词：鸡球虫病；卵黄抗体；保护试验引言鸡球虫病广泛存在于养鸡业中，常造成大批死亡，其死亡率可最高达80％，且病愈鸡生长严重受阻，抵抗力降低，易继发其他疾病。
每年，全世界因为鸡球虫病造成的损失高达数十亿美元[1]。
因此，鸡球虫病是养鸡业中危害最严重的疾病之一。
在我国，特别是在南方地区，由于气温高、湿度大，这种环境利于球虫卵囊的孢子发育，本病常常呈暴发性流行，危害更加严重。
然而，目前对鸡球虫病的防治措施绝大部分多依赖于药物的预防和治疗上,即化学合成药物和抗生素两大类，自从1936年首次出现专用抗球虫药以来，已报道的抗球虫药达40余种，但是因为球虫对药物极易产生抗药性，大量使用化学药物势必会造成严重的药物残留问题等，这也是当今养禽业所遇到最棘手的问题之一。
上述问题存在，为临床防治鸡球虫病提出紧迫任务。
卵黄抗体在禽胚孵化过程中逐渐进入禽胚血液，为刚出壳雏鸡提供被动免疫保护，在雏鸡疾病预防中具有重要作用。
这种策略得到良好的运用，如鸡法氏囊卵黄抗体在一定程度上解决了临床治疗该病难题，为生产作出了一定的贡献。
卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1：2。
大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。
因此IgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY[2]。
多年来，已建立了许多较为高效而经济的方法，这些方法大多以PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。
工业上大规模生产IgY的方法有：超临界二氧化碳气体抽提法、卡拉胶法、硫酸铵盐析法[3]。
开展抗球虫卵黄抗体的研究对家禽球虫病的预防及治疗具有重要意义：(1)该方法建立，为临床防治鸡球虫病提供新思路和策略，可在一定程度上减少抗生素的使用和减少化学药物残留问题。
(2)这种卵黄抗体具有生物活性的免疫球蛋白，具有效应特异性，在应用于临床预防该病时，不仅可有效激活肠道粘膜免疫，还可诱发其他免疫（体液免疫）。
因此，该抗体具有多重效应特点。
(3)此外，该抗体可高批量生产，且成本低，有利于规模化生产。
综上所述，本项目开展鸡球虫卵黄抗体制备及其效应的检测，旨在为生产中预防鸡球虫病的发生和降低经济损失提供一种有益的探索。
1.材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器垂直板型电泳槽和直流稳压电源：北京六一电泳仪器厂；离心机：高速离心机；水浴锅；超声粉碎仪1.1.2 试材烧杯，玻棒，微量注射器（20μl、50μl、200μl、1000μl、2000μl），玻璃板，吸量管；常头滴管，pH试纸，96孔微量板，研钵等1.1.3动物刚孵出的肉用雏鸡以及成年蛋鸡（肥西县官亭某养鸡场）1.1.4 试剂丙烯酰胺：购自上海生物有限公司；Tris碱：购自北京天庚生物有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂：购自Sigma公司；硫酸铵：HCl ； SDS AP ；β-锍基乙醇 0.1%溴酚蓝； TEMED ；甘油；考马斯亮蓝 R250；重络酸钾；双蒸水：自备。
1.1.5 溶液配制溶液配制：(1)0.01M pH 7.4 PBS：NaH2PO4·2H2O 0.260g Na2HPO4·12H20 2.17g配制1000ml 调节pH=7.4(2) 0.01M Tris-HCL Tris0.605g 配制500ml 1M HCL 调节Ph8.0；SDS-PAGE电泳溶液配制：(1)30%分离胶贮液（丙烯酰胺溶液100ml)(2)分离胶缓冲液（1.5mol/l Tris-HCl缓冲液 pH8.8 ,100ml）称取Tris 18.17g溶于80ml单蒸水中，用浓盐酸调pH至8.8，蒸馏水定容至100ml.(3)浓缩胶缓冲液（1.0MOL/LTris-HCl缓冲液 PH6.8,100ml）称取Tris 12.11g溶于80mldH2O 中，用浓盐酸调pH至6.8，蒸馏水定容至100ml. (4)10%SDS溶液(50ml)5g SDS加入到40ml单蒸水中，65℃加热使其溶解，用浓盐酸调制pH至7.2，定容至50ml. ( SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)(5)10%（AP）现用现配，称取1g过硫酸铵溶于10ml单蒸水中。
(6)2×SDS上样缓冲液（5ml)1.0mol/l Tris-HCL(PH6.8) 0.5ml；β-锍基乙醇 0.5ml；10%SDS2.0ml；0.1%溴酚蓝0.25ml；甘油1mL；蒸水 0.75ml。
(7)电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液）称取Tris 3.02g, 甘氨酸18.9g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。
(8)考马斯亮蓝脱色液(500ml)50mL冰乙酸，225mL重蒸水与50mL甲醇混匀、避光保存。
(9)0.25%考马斯亮蓝R250染色液(500ml)考马斯亮蓝脱色液500ml，加入考马斯亮蓝R2501.25g ，充分溶解，避光保存。
1.1.6 虫株混合球虫孢子化卵囊，来自田间动物感动。
1.1.7试验动物新出生雏鸡和蛋鸡，来自合肥肥西县某养鸡场。
1.2方法1.2.1卵囊收集、纯化、增殖（1）卵囊的分离和纯化：刮取发病鸡盲肠粘膜以及病鸡粪便通过过筛后，经饱和食盐漂浮法分离球虫卵囊，具体步骤可参照索勋等方法，不再详述[4]。
然后将卵囊置于2.5%重铬酸钾溶液中进行孢子化。
（2）卵囊的增殖：上述所分离的球虫卵囊接种17日龄雏鸡(无球虫污染的环境饲养)，接种量为8×105个孢子化卵囊/只进行卵囊增殖，给予充足饮食与饮水，逐日观察试验动物状态和粪便情况，于感染7天后收集粪便和肠道中的卵囊。
1.2.2免疫对增殖卵囊进行计数，以每只蛋鸡攻105个卵囊为标准并对卵囊进行超声粉碎，然后将抗原液与弗氏完全佐剂等体积混合制备抗原，进行首免。
二免时用抗原液与弗氏不完全佐剂等体积混合，然后接种动物。
以肌肉多点注射的方式对10只体况相同的蛋鸡进行首次免疫，14天后以相同方式进行加强免疫，在初次免疫7天后连续收集鸡蛋[5]。
1.2.3卵黄抗体分离与纯化采用水稀释硫酸铵盐析法分离相关抗体，并用PEG进一步提纯。
（1）分离蛋黄液取鸡蛋，打一小孔，流出蛋清；从小孔内加入无菌水，重复3次；将蛋黄在滤纸上滚动；刺破蛋黄膜，收集蛋黄液。
（2）水溶稀释法粗提抗体用1:9 倍的蒸馏水稀释卵黄, 利用0.1% 的盐酸调节蒸馏水pH 至5.0-5.4, 搅拌15 min, 置4 ℃过夜后脂蛋白自然沉淀,以10000 r/min, 4 ℃离心25 min 去除脂类, 收集上清液即可。
（3）硫酸铵两步法盐析纯化用水稀释法粗提卵黄获得水溶性成分200ml, 加入等体积200mlPBS( pH7.4) 稀释, 再入饱和硫酸铵400ml ,使硫酸铵浓度为50%, 4 ℃度静置30min以上, 9000 r/min 离心15min, 弃上清。
再用200mlPBS 溶解沉淀，离心去除不溶物，取上清液加入100ml饱和硫酸铵至33% 饱和度， 4 ℃静置30min以上， 9000 r/min 离心15min, 取沉淀。
如此重复2 ~ 3 次，可获较纯的IgY。
（4）PEG透析纯化将IgY溶解液灌入透析袋中，两端封口放入PEG-20000中透析，得到高浓度的IgY。
（5）SDS-PAGE方法鉴定分离的抗体[6]（a）分离胶制备：按表1配制20ml 12%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。
约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。
倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
（b）浓缩胶的制备：按表2配制10ml 5%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。
再静置30min，待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH=8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。
表1 12%分离胶（5ml)配制方案Tab 1 Formula of 12% separation gel溶液体积（ml）40%Acr-Bis 1.51.5mol/L Tris-HCL （pH8.9) 1.2510%SDS 0.05TEMED 0.002去离子水 2.1510%过硫酸铵0.05表2 5%浓缩胶（3ml)配制方案Tab 2 Formula of 5% concentration gel溶液体积（ml）40%Acr-Bis 0.3751.5mol/l Tris-HCL（pH6.8) 0.3810%SDS 0.03TEMED 0.003去离子水 2.22510%过硫酸铵0.03（c）样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5～1mg/mL，沸水浴加热3min，冷却至室温备用。
处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合。
一般加样体积为15μL（即2－10μg蛋白质）。
如样品较稀，可增加加样体积。
用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
（d）电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电压调至50V。
待样品进入分离较时，将电压调至90V。
当蓝色染料迁移至底部时，将电压调回到零，关闭电源。
拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
