免疫组化的经验总结

免疫组化技术自我总结一、实验步骤（SABC法）1．动物准备成年SD大鼠用1％戊巴比妥腹腔注射麻醉(剂量1ml/100g)。

2．取材、固定（以取脑组织为例）1) 将麻醉后的动物仰面固定，用水湿润毛皮，暴露心脏。

2) 用剪刀在左心室剪开一道小口，插入灌注针头至主动脉，用止血钳自心室钳紧。

3) 用37℃生理盐水灌注，剪开右心耳，至流出液体变清亮为止。

4) 立即注入Zamboni’s固定液300-400ml(灌注时先快后慢，约15分钟结束。

5) 灌注后剥离脑组织并修块后置于固定液中(6-18h)。

3．玻片处理（可直接购买包被好的防脱载玻片）新的载玻片和盖玻片须经清洁液浸泡12-14h，流水充分冲洗后，蒸馏水清洗5次，入95％乙醇2h以上，用精白布擦干，置切片盒内备用。

用前用硌钒明胶包被或者用0.01％多聚赖氨酸等均匀涂在载玻片上，贴片后入烘箱中烤1-2小时，取出置-20℃冰箱内储存。

4．制片切片前将标本移入30％蔗糖溶液中(用固定液配)，直到标本沉入瓶底。

在标本上滴上OCT，于-70℃快速冻5分钟，后放入-20℃冰冻切片机内50分钟后准备切片，切片后收集在固定液中或0.01M PBS 4℃保存备用，或贴于载玻片上。

5. 抗体特异性检测及阴性对照运用1：50、1：100、1：200、1：300、1：400、1：500的兔来源的一抗、1：200生物素标记的二抗以及SABC复合物进行免疫细胞化学实验。

一抗对照采用抗原吸收肽、0.01MPBS，二抗对照采用未用生物素标记的IgG以及0.01MPBS。

6．免疫组化1) 贴片或捞片经0.01M PBS漂洗5分钟×3次。

2) 0.3％H2O2，15分钟。

3) 滴加封闭用山羊血清或者0.3% Triton X-100 / 4% BSA封闭液37℃孵育30分钟。

4) 用滤纸吸去多余血清，滴加不同浓度一抗，37℃ 2小时，后入4℃冰箱过夜。

5) 0.01M PBS漂洗5分钟×3次。

免疫组化实验训练小结引言免疫组化实验是一门重要的分子生物学技术，用于检测和鉴定蛋白质、细胞器和细胞膜等在组织或细胞中的分布和表达情况。

通过特定的抗体与目标物质结合，并利用染色反应产生可见的信号来检测感兴趣分子的存在与定位。

在本次实验训练中，我研究了免疫组化实验的基本原理和操作步骤，并对所使用的抗体和细胞进行了染色和观察。

本文将对实验过程、结果和收获进行总结。

实验过程1. 准备样本：收集所需样本，保证其完整性和新鲜度。

2. 样本处理：根据需要，将样本进行固定、解冻、切片等预处理步骤。

3. 免疫反应：将样本与特定抗体进行孵育反应，使抗体与目标物质结合。

4. 洗涤步骤：使用缓冲液对样本进行洗涤，去除非特异性结合的抗体。

5. 二次抗体标记：用与特异抗体结合的二次抗体进行标记，以增加可见信号。

6. 洗涤步骤：再次用缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合的二次抗体。

7. 染色反应：将染色底物添加到样本中，观察免疫反应产生的信号。

实验结果经过实验操作，我得到了如下结果：1. 目标物质在样本中的分布情况：通过观察染色结果，我可以清晰地看到目标物质在细胞膜、细胞质或细胞核等位置的分布情况。

2. 表达定量：通过评估染色强度，可以初步了解目标物质在样本中的表达水平。

3. 抗体的特异性：观察结果可以评估所使用抗体的特异性，确保实验结果的准确性和可靠性。

实验遇到的问题与解决方法在实验过程中，我遇到了一些问题，如失去目标物质的信号、非特异性背景染色的问题等。

为了解决这些问题，我采取了以下措施：1. 优化抗体浓度：尝试不同浓度的抗体，找到最适合的工作浓度。

2. 增加洗涤次数：增加洗涤步骤的次数，以减少非特异性结合的抗体。

3. 更换染色底物：尝试不同的染色底物，选择能够产生明亮和清晰信号的底物。

总结与收获通过本次免疫组化实验训练，我深入了解了免疫组化技术的原理和操作步骤。

在实验过程中，我学会了处理样本、操作免疫反应和观察染色结果的方法。

提醒0» »窗体顶端版内版内全站搜索窗体底端1...【原创】免疫组化成功的经验和失败的教训汇总 [精华]丁香园版主2007-09-22 10:37 分享分享到哪里？本人最近已做石蜡切片的免疫组化多次，多是成功的，但也遇到许多预想不到的结果和现象，现汇总问题如下，望高手们参与讨论，给出正确的、完整的、权威答案。

同时也希望大家补充问题，共同交流经验、体会、感悟。

1. 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？2. DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？3. 免疫组化结果老是出现阴性结果？4. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？5. 一抗从4度拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？6. 免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？尤其是微波修复。

7. 有人在一抗孵育前用tritonX100来通透细胞，对石蜡切片需要否？8. 苏木素复染的时间应该是多少？复染过度咋办？9. 抗原修复应在灭活POD之前还是之后？10. DAB显色时间到底多少为最佳？一定要是3~10分钟吗？11. DAB呈色后到底什么样染色是特异性染色？。

相关链接：【整理】免疫组化技术资料大全（原理、步骤、注意事项、教程及常见问题解答）【整理】免疫荧光组织（细胞）化学和免疫胶体金技术大全（原理、试剂和器材、操作流程、常见问题及其解决方法）【原创】免疫组化技术常见问题及其解答集锦票数论文版历年精品荟萃wh2008 edited on 2008-07-20 19:26 •2007-09-22 10:56 分享分享到哪里？丁香园版主针对问题2着色不均匀：1. 脱蜡不充分。

可以60度烤20min，立即放入新鲜的xylene1－2；2. 水化不全。

应经常配制新鲜的梯度乙醇；3. 抗体没混匀。

用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；4. 抗体孵育时，切片放倾斜；5. 抗体孵育后PBS冲洗不充分。

6. 制片厚薄不均匀等问题。

免疫组化主管月总结
（原创版）
目录
1.引言
2.本月工作总结
3.本月工作亮点
4.工作中遇到的问题与解决方案
5.下月工作计划
6.总结
正文
一、引言
随着现代生物医学技术的发展，免疫组化技术在疾病诊断、治疗以及科研领域中的应用越来越广泛。

作为一名免疫组化主管，对本月的工作进行总结，以便更好地发现工作中的优点与不足，提高工作效率和质量。

二、本月工作总结
本月共完成了 20 个免疫组化实验项目，涉及 15 种不同的疾病诊断和科研课题。

所有项目均按照规定的时间节点完成，并在规定时间内出具了准确的实验报告。

三、本月工作亮点
1.优化了实验操作流程，提高了实验成功率。

2.引入了新的免疫组化试剂，拓宽了检测范围。

3.对实验室人员进行了业务培训，提高了整体业务水平。

四、工作中遇到的问题与解决方案
1.问题：部分实验结果与预期不符。

解决方案：对实验过程进行仔细审查，发现问题所在，并针对性地调整实验方案。

2.问题：实验室人员对新试剂的使用不熟练。

解决方案：组织培训，加强实验室人员对新试剂的掌握。

五、下月工作计划
1.继续优化实验操作流程，提高实验成功率。

2.对实验室人员进行定期业务培训，提高整体业务水平。

3.对实验室设备进行维护和更新，确保实验质量。

六、总结
通过对本月工作的总结，我们发现在免疫组化实验方面取得了一定的成绩，但仍存在一些问题。

免疫组化经验总结免疫组化经验总结冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？1、从一抗的选择方面来看。

有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。

2、从研究目的来看。

石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。

3、从抗原的保真性来看。

冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程中可能会对抗原的性质造成影响。

4、从操作步骤的繁琐程度看。

染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。

5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。

如何避免荧光素提前衰退？1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。

6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。

普通荧光显微镜的操作指南和注意事项？1、操作指南：（1）关闭房间内的电灯，开启显微镜汞灯。

为延长汞灯的使用寿命，汞灯开启不到15-30分钟的请在15-30分钟后关闭汞灯。

免疫组化经验总结第⼀部分步骤及常见问题免疫组化技术流程及常见问题解析（修改版）说明：加粗的字体部分是我认为要注意的地⽅和提出的问题，⽽红⾊字体部分表⽰还不太确定的第⼀部分载玻⽚与盖玻⽚的处理：载玻⽚与盖玻⽚重铬酸钾浸泡1-2天，⽔清洗直到没有颜⾊为⽌，放⼊⽆⽔⼄醇中，⽤纱布擦⼲（如需开展原位杂交，还需将玻⽚240℃烤2h），载玻⽚涂上多聚赖氨酸，37度烘⼲，备⽤第⼆部分冰冻切⽚前期处理1冰冻切⽚组织处理。

肿瘤组织从体内取出后，迅速放于液氮中冰冻，然后放于－８０度保存，切⽚时先⽤OCT 固定（尽量减少⽓泡⽣成），-20度20-30分钟固定好后即可切⽚（最好时间长⼀点，时间太短容易使切⽚卷起，也使切⽚不均匀）。

2切⽚，切⽚时要慢，稳⼀点，切好后⽤涂有多聚赖氨酸的载玻⽚粘取切下的组织⽚，粘的时候有⼀个向内拉伸的动作，这样可以使组织⽚充分展开。

⽚⼦的厚度⼀般为10um,也有的要切30um（根据需求调整）。

切好的⽚⼦⽴即放⼊4﹪的新配的多聚甲醛中处理8-10分钟(或在丙酮中固定10S，具体⽤什么固定要看⼀抗的要求)3 PBS中洗⼀下（约2分钟）去掉残留的多聚甲醛。

（丙酮切⽚的话省去本步骤）（从冰箱中取出的⽚⼦最好在PBS中浸泡2分钟，再往下做。

如果打孔不充分，可以在PBS 中加⼊triton x-100洗三次。

再⽤PBS洗⼏次，除去triton x-100）4 ⽚⼦切好后可放于37度烘⼲，但是时间不要太长，2-3⼩时即可，或者室温风⼲，然后放于-20度或-80度冰箱可长期储存。

但是⽤丙酮或有机溶剂固定的⽚⼦上如果还有其他有机溶性的染料的话建议尽快做掉，因为有机溶剂在长期储存中（⼀个⽉）缓慢作⽤的话，也会使染料变得模糊。

第三部分加抗体5 10％正常⼭⽺⾎清（PBS稀释，可加少量的triton x-100打孔），封闭（依⼆抗的来源⽽定），室温孵育30分钟。

6倾去⾎清，擦⼲各组织之间的⽔滴，防⽌有⽔滴粘连。

滴加适当⽐例稀释的⼀抗1：100左右或⼀抗⼯作液，37℃孵育1~2⼩时或4℃过夜，4℃过夜后需在37℃或室温复温30分钟。

免疫组化阶段总结一实验所用试剂配方：1 苦味酸饱和液的配制：1 缓冲液：1×TBS:6.06g TRIS,8.5g NaCL，先加超纯水溶解（约800ml）然后使用pH计调节pH至7.4，定容至1L。

2 抗原修复液：根据Sigma抗体说明书配制。

1×柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/l）：二水柠檬酸三钠2.941g；0.292g EDTA 加超纯水溶解（约800ml），调节pH至6.0，定容至1L。

1×Tris/EDTA：4.84g Tris,3.72g EDTA,加超纯水溶解（约800ml）调pH至9.0, 定容至1L（先加较多NaOH）。

3 细胞通透液：使用超纯水配制0.5﹪Tritonx-100，在100ml 超纯水中加入0.5ml Tritonx-100后轻轻搅拌，尽量不要产生气泡，直至溶解完全方可使用。

4 封闭血清：根据二抗来源选择封闭血清，一般血清来源于二抗来源形同。

血清浓度为10％,TBS配制，或者使用3﹪BSA配制10﹪封闭血清。

5 抗体稀释液：使用TBS配制3﹪BSA。

6 3﹪H2O2：30﹪H2O2，超纯水配制。

7 DAB显色液（试剂盒）配制：1mlTBS中加50mlA液，50mlB 液，充分混匀。

8 荧光二抗的配制：Alexa Flour488、594规格为2mg/ml,说明书建议使用浓度在2ug/ml-10ug/ml之间，所以建议稀释200-1000倍，本实验所使用浓度为5ug/ml，即稀释400倍。

二组织采集与处理材料：取不同时间点猪的睾丸组织观察精原干细胞的表达，新生小猪，3-5月龄,成年猪。

采集适龄猪睾丸组织，置于PBS中带回实验室，用PBS清洗若干次，将睾丸白膜去除，组织切成适宜大小，用苦味酸固定过夜，次日进行清洗（PBS）3-4次，每次30min,然后用70％酒精清洗3次，每次30min，储存于70％酒精备用。

包埋：80％酒精--90％酒精—100％Ⅰ酒精--100％Ⅱ酒精各30 min，无水乙醇：二甲苯1:1 2h，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ依照所取组织大小确定处理时间，二甲苯：石蜡1:1 2h,石蜡Ⅰ1h,石蜡Ⅱ2h，包埋。

免疫组化免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

免疫组化实验所用的组织和细胞标本：实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法抗原修复——原因：常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

进行抗原暴露和修复的原则：1、寻找抗体说明的有关信息2、如无信息可先不经处理做免疫组化3、如染色结果呈阴性或阳性结果不理想，可用酶消化4、如还不理想用高温办法处理5、如再不理想可用酶和高温相结合处理6、如仍然是阴性结果，可能该抗体质量有问题。

常用的抗原修复方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法1．柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法（1）适用范围：适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。

（2）仪器设备：普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。

（3）试剂：0.01M 柠檬酸型缓冲液，pH6.0。

（3）操作步骤：①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。

免疫组化实战经验总结1、切好的切片最好放在4摄氏度左右冰箱里，抗原较不容易丧失。

把要做的切片先分好，做几个抗体可分几盒，还有不正常组织与正常组织要分开。

其余做预实验用。

2、选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。

3、试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。

如：肝组织生物素含量高，S-P试剂盒生物素含量也高，故不能配合使用。

4、关于抗体试剂等购买，可多家比较，尽可能询问详细。

最好买下该公司的阳性片。

切记尽可能不要先付钱，等预实验成功后再付，还有尽可能节省，因为会有太多你意想不到的情况，都是需要花钱解决的。

买的量尽可能一次性到位，能省就省，风险大的尽量不要省。

若实验过程有问题，大可尽量与该公司技术部联系，寻求解决方案。

若是怀疑抗体质量问题，可要求换货，态度要强硬，协议流程一次到位，不可被对方牵着鼻子走，否则最终结果只能是浪费时间。

若是抗体浓缩液，个人觉得国内的应该都可以做出阳性来，不是国内买不到的话，可考虑国产的，可便宜很多。

5、每次开始做时，都必须先清点实验的必需品是否齐全。

想好可能发生的意外，并先想好补救措施。

6、首次预实验先拿出多张不同的组织切片按最常规的条件进行，若没阳性再拿多张不同组织片（可以与首次相同），条件要适当改进，可先找出一个阳性区域，再深入改进。

7、烤片（单一或综合）程度要适情况而定，可中途拿出甩一甩，尽可能先放在烤箱里烤3小时以上。

切勿把片烤得太久了。

程度刚好，脱蜡效果才会好。

注意做好不同条件的切片标记。

注意温度稳定，再烤片。

8、抗原修复与烤片：温度高低，缓冲系统。

9、二甲苯脱蜡，若是天气太冷，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，同时也可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡，这样会更彻底，效果会更好，若是天气不会太冷，那还是室温下脱蜡，要不可能会适得其反。

时间也是适情况而定。

10、脱水与水化。

酒精梯度不同。

高低相反。

11、甲醛固定会导致蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。

免疫组化（IHC）经验超全总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。

我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。

经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。

一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。

因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。

2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。

缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。

当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。

3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。

由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

1.单克隆和多克隆抗体的选择。

由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。

单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。

另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。

在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。