六章沉淀反应
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普通化学 PPT课件-第六章 沉淀溶解反应
（2）若Q= Ksp ， △G=0，溶液为饱和溶液。反应处于平衡状态；
（3）若Q＜ Ksp ， △G ＜0，溶液为不饱和溶液。无沉淀生成 或已有的沉淀溶解。
溶度积规则
[例3-18] 已知在298K时，PbI2的Ksp =8.49×10－9。问（1）在 0.010mol·L-1Pb(NO3)2溶液中加入等体积的0.010mol·L－1KI溶液时， 是否有PbI2沉淀产生？（2）如果加入等体积的KI溶液后，混合溶液 中的C(Pb2＋)和C(I－)的离子积，恰好达到PbI2的溶度积，求这KI溶 液的浓度。
A. 增大 B. 减小 C. 相同 D. 无法判断
盐效应
3.溶度积规则
rG m (T) RT ln K RT ln Q
化学反 应等温 方程式
AmBn（s）
mAn+（aq） + nBm-（aq）
Qsp Cm (An ) Cn (Bm )
（1）若Q＞ Ksp ，△G ＞0，溶液为过饱和溶液。有沉淀生成；
A. AgCl (1.8 x 10-10)
Ksp = S2
S=1.34×10－5
B. Ag2C2O4 (3.4 x 10-11)
Ksp = 4S3
S=2.40×10－4
C. Ag2CrO4 (1.1 x 10-12) D. AgBr (5.2 x 10-13)
例： Hg2Cl2 的KSP为1.3 x 10-18 ,0.1升饱和溶液的浓度
沉淀
Ksp Cm (An ) Cn (Bm )
溶度积原理
rG
m
(T)
RT
ln
K
sp
f
G
m
/
kJ
mol
AgCl(s) -109.80
第六章 沉淀滴定法
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兰州石化职业技术学院 石油化学工程系
第六章 沉淀滴定法 使用,若pH<7则主要以HFIn形式存在,无法指示终点, 因此溶液的pH应有利于吸附指示剂阴离子的存在. (3) 卤化银沉淀对光敏感,易分解而析出金属银使沉淀变为 灰黑色,故滴定过程要避免强光 避免强光,否则,影响滴定终点 避免强光 的观察. (4) 指示剂吸附性能要适中.胶体微粒对指示剂的吸附能力 要比对待测离子的吸附能力略小,否则指示剂将在化学 计量点前变色.但如果太小,又将使颜色变化不敏锐. 卤化银对卤化物和几种吸附指示剂的吸附能力的次序如下:
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第六章 沉淀滴定法 沉淀滴定法 沉淀滴定法是以沉淀反应为基础的一类滴定分析方法. 目前应用最多的是生成难溶银盐的反应.例如:
银量法:利用生成难溶银盐反应的测定方法称为银量法. 银量法可以测定Cl-,Br-,I-,Ag+,CN-,SCN-等离子.按照指 示滴定终点的方法不同而分为三种:莫尔(Mohr)法,佛尔哈 德(Volhard)法和法扬斯(Fajans)法.
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第六章 沉淀滴定法 佛尔哈德法——铁铵矾作指示剂 二, 佛尔哈德法 铁铵矾作指示剂 以铁铵矾[NH4Fe(SO4)212H2O]作指示剂,在酸性介 质中,用KSCN或NH4SCN为标准溶液滴定. 1, 直接滴定法 原理: 原理: 在含有Ag+的硝酸溶液中加入铁铵矾指示剂,用 NH4SCN标准溶液滴定,先析出白色的AgSCN沉淀,到达 化学计量点时,微过量的NH4SCN就与Fe3+生成红色 FeSCN2+,指示滴定终点到达.其反应为:
在化学计量点前,溶液中有剩余的Cl-存在,AgCl沉淀 吸附Cl-而带负电荷,因此荧光黄阴离子留在溶液中呈黄绿 色.滴定进行到化学计量点后,AgCl沉淀吸附Ag+而
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第六章 沉淀滴定法 使用,若pH<7则主要以HFIn形式存在,无法指示终点, 因此溶液的pH应有利于吸附指示剂阴离子的存在. (3) 卤化银沉淀对光敏感,易分解而析出金属银使沉淀变为 灰黑色,故滴定过程要避免强光 避免强光,否则,影响滴定终点 避免强光 的观察. (4) 指示剂吸附性能要适中.胶体微粒对指示剂的吸附能力 要比对待测离子的吸附能力略小,否则指示剂将在化学 计量点前变色.但如果太小,又将使颜色变化不敏锐. 卤化银对卤化物和几种吸附指示剂的吸附能力的次序如下:
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第六章 沉淀滴定法 沉淀滴定法 沉淀滴定法是以沉淀反应为基础的一类滴定分析方法. 目前应用最多的是生成难溶银盐的反应.例如:
银量法:利用生成难溶银盐反应的测定方法称为银量法. 银量法可以测定Cl-,Br-,I-,Ag+,CN-,SCN-等离子.按照指 示滴定终点的方法不同而分为三种:莫尔(Mohr)法,佛尔哈 德(Volhard)法和法扬斯(Fajans)法.
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第六章 沉淀滴定法 佛尔哈德法——铁铵矾作指示剂 二, 佛尔哈德法 铁铵矾作指示剂 以铁铵矾[NH4Fe(SO4)212H2O]作指示剂,在酸性介 质中,用KSCN或NH4SCN为标准溶液滴定. 1, 直接滴定法 原理: 原理: 在含有Ag+的硝酸溶液中加入铁铵矾指示剂,用 NH4SCN标准溶液滴定,先析出白色的AgSCN沉淀,到达 化学计量点时,微过量的NH4SCN就与Fe3+生成红色 FeSCN2+,指示滴定终点到达.其反应为:
在化学计量点前,溶液中有剩余的Cl-存在,AgCl沉淀 吸附Cl-而带负电荷,因此荧光黄阴离子留在溶液中呈黄绿 色.滴定进行到化学计量点后,AgCl沉淀吸附Ag+而
第六章沉淀滴定法解析
砖红色Ag2CrO4 沉淀所需的浓度为7.1×10-3mol/L。
化学工业出版社
第二节 铬酸钾指示剂法
[Ag+] = [Cl-] = KSp, AgCl
10 = 1.5610 =1.25×10-5mol/L
= 如果此时恰好生成砖红色 Ag2CrO4沉淀，则所需浓度为：
[CrO2 ]= 4
K sp , Ag 2 CrO 4
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第二节 铬酸钾指示剂法 （二）0.1mol/L AgNO3滴定液的标定 称取在110℃干燥至恒重的基准NaCl 0.12g，置 于250ml锥形瓶中，加纯化水50ml使其溶解，加5% （g/ml）K2CrO4指示剂1ml，用0.1mol/L AgNO3 滴 定液滴定至混悬液呈浅的砖红色，即为终点。平行 实验3次。正确记录数据并进行结果分析。
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第三节 铁铵矾指示剂法 终点前 Ag+ ＋SCN终点时 Fe3+ ＋SCNAgSCN↓(白色)
[Fe(SCN)]2+(棕红色)
滴定时，溶液的pH一般控制在0～1之间。在 滴定过程中，由于AgSCN沉淀吸附作用很强，部 分Ag+会被吸附在沉淀表面，所以滴定时，必须充 分摇动，使被吸附的Ag+ 及时地释放出来，以防止 终点过早出现，导致分析结果偏低。
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第三节 铁铵矾指示剂法
1．直接滴定法测定Ag+
直接滴定法是在酸性溶液中，以铁铵矾为指 示剂，用KSCN或NH4SCN滴定液滴定Ag+溶液的 银量法。在滴定过程中， Ag+ 首先与SCN-反应生 成AgSCN白色沉淀，当Ag+ 沉淀完全后，稍过量 的滴定液SCN-与Fe3+结合生成[Fe(SCN)]2+配离子， 使溶液呈现棕红色，即表示到达滴定终点。
沉淀反应
第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。
第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。
第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：（一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。
（二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。
（三）方阵滴定法方阵滴定法即棋盘滴定法。
二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。
（一）免疫比浊测定的影响因素1.抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。
当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。
当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。
2.抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1）特异性强：抗血清最核心的要求是单价特异性，即该抗体只针对某一种抗原，与其他无关抗原不发生交叉反应，特异性抗体和相应抗原结合后形成的浊度代表真实的试验结果。
（2）效价高：低效价（＜1:20）抗体会增加非特异性浊度（伪浊度）的产生。
（3）亲和力强：则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC较牢固，不易发生解离。
在速率比浊法中尤为重要。
（4）R型和H型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型抗体和H型抗体。
无机化学第6章 难溶强电解质的沉淀-溶解平衡
✓ Ksp反映的方程式，难溶电解质在反应物的 位置，即方程式的左边
常见难溶强电解质的溶度积
二、标准溶度积常数与溶解度 的关系
一定温度下，溶度积和溶解度都可表示难 溶电解质在水中的溶解能力。
若溶解度s 的单位用mol.L-1，称为摩尔溶 解度。
注意：推导若溶度积和溶解度关系时， 溶解度采用摩尔溶解度。
2. 溶度积与溶解度
二、标准溶度积常数与溶解度的关系
难溶强电解质Mv Av饱和溶液中存在沉淀-溶解平衡：
MvAv (s) vMz (aq) vAz (aq)
1－2型
如：Ag2CrO4 (s) 2Ag+ (aq) + CrO42- (aq)
2s
s
Ksp ={ceq (Ag+ )}2 {ceq (CrO42- )}＝ (2 s)2 (s)
Question
我们常说的沉淀，是不是一点都不溶？
例：
实验：取上层清液适量
滴加少量KI溶液
黄色沉淀(AgI)
AgCl
是否含有 s(AgCl)=1.34×10-5 mol·L-1
Ag+、Cl-
=1.92×10-4克/100mL
Question
我们常说的沉淀，是不是一点都不溶？
例：
AgCl(s) 溶解 AgCl(aq) 沉淀
AgCl(aq)
解离 Ag+ (aq)+ Cl-(aq) 分子化
AgCl
是否含有
AgCl(s)
溶解 Ag+ (aq)+ Cl-(aq) 沉淀
Ag+、Cl-
沉淀-溶解平衡
图 6-1 难溶强电解质的溶解和沉淀过程
沉淀溶解平衡
难溶强电解质Mv+Av-饱和溶液中存在如下动态平衡：
常见难溶强电解质的溶度积
二、标准溶度积常数与溶解度 的关系
一定温度下，溶度积和溶解度都可表示难 溶电解质在水中的溶解能力。
若溶解度s 的单位用mol.L-1，称为摩尔溶 解度。
注意：推导若溶度积和溶解度关系时， 溶解度采用摩尔溶解度。
2. 溶度积与溶解度
二、标准溶度积常数与溶解度的关系
难溶强电解质Mv Av饱和溶液中存在沉淀-溶解平衡：
MvAv (s) vMz (aq) vAz (aq)
1－2型
如：Ag2CrO4 (s) 2Ag+ (aq) + CrO42- (aq)
2s
s
Ksp ={ceq (Ag+ )}2 {ceq (CrO42- )}＝ (2 s)2 (s)
Question
我们常说的沉淀，是不是一点都不溶？
例：
实验：取上层清液适量
滴加少量KI溶液
黄色沉淀(AgI)
AgCl
是否含有 s(AgCl)=1.34×10-5 mol·L-1
Ag+、Cl-
=1.92×10-4克/100mL
Question
我们常说的沉淀，是不是一点都不溶？
例：
AgCl(s) 溶解 AgCl(aq) 沉淀
AgCl(aq)
解离 Ag+ (aq)+ Cl-(aq) 分子化
AgCl
是否含有
AgCl(s)
溶解 Ag+ (aq)+ Cl-(aq) 沉淀
Ag+、Cl-
沉淀-溶解平衡
图 6-1 难溶强电解质的溶解和沉淀过程
沉淀溶解平衡
难溶强电解质Mv+Av-饱和溶液中存在如下动态平衡：
分析化学 第六章 重量分析法和沉淀滴定法
分析化学
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3.电解法
利用电解原理，使待测金属离子在电极上还原析出， 然后称重，电极增加的重量即为金属重。 重量分析法优点:其准确度较高，相对误差一般为 0.1-0.2%。
缺点：
程序长、费时多，操作繁琐，也不适用于微量组 分和痕量组分的测定。
分析化学
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二、沉淀重量法对沉淀形式和称量形式的要求
Ba2+ SO42SO42- Ba2+ SO42SO42-
沉淀
Ba2+
Cl
-
Ca2+
K+
Ba2+ SO42Cl SO42- Ba2+ SO4
2-
Ca2+
Na+ Cl
-
Ba2+ SO42吸附层 扩散层
分析化学
通辽职业学院
（2） 吸留和包藏 吸留（occlusion):在沉淀过程中，若生成沉淀 的速度过快，则表面吸附的杂质来不及离开沉淀表面 就被沉淀下来的离子所覆盖，而杂质就被包藏在沉淀 内部，从而引起共沉淀。 包藏（inclusion):在沉淀过程中，母液也可能 被包夹在沉淀当中，从而引起共沉淀。 （3）混晶 当杂质离子的半径与构晶离子的半径相近时，所形 成的晶体结构相同，则它们极易生成混晶。 如：BaSO4和PbSO4, AgCl和AgBr. BaSO4和KMnO4等。 分析化学
K sp
K ap
②对于MmAn型沉淀，溶度积的表达式为：
MmAn
mM + nA
[Mn ]m [Am- ]n Ksp
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（2）条件溶度积 MA M
OH
+
+
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3.电解法
利用电解原理，使待测金属离子在电极上还原析出， 然后称重，电极增加的重量即为金属重。 重量分析法优点:其准确度较高，相对误差一般为 0.1-0.2%。
缺点：
程序长、费时多，操作繁琐，也不适用于微量组 分和痕量组分的测定。
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二、沉淀重量法对沉淀形式和称量形式的要求
Ba2+ SO42SO42- Ba2+ SO42SO42-
沉淀
Ba2+
Cl
-
Ca2+
K+
Ba2+ SO42Cl SO42- Ba2+ SO4
2-
Ca2+
Na+ Cl
-
Ba2+ SO42吸附层 扩散层
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（2） 吸留和包藏 吸留（occlusion):在沉淀过程中，若生成沉淀 的速度过快，则表面吸附的杂质来不及离开沉淀表面 就被沉淀下来的离子所覆盖，而杂质就被包藏在沉淀 内部，从而引起共沉淀。 包藏（inclusion):在沉淀过程中，母液也可能 被包夹在沉淀当中，从而引起共沉淀。 （3）混晶 当杂质离子的半径与构晶离子的半径相近时，所形 成的晶体结构相同，则它们极易生成混晶。 如：BaSO4和PbSO4, AgCl和AgBr. BaSO4和KMnO4等。 分析化学
K sp
K ap
②对于MmAn型沉淀，溶度积的表达式为：
MmAn
mM + nA
[Mn ]m [Am- ]n Ksp
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（2）条件溶度积 MA M
OH
+
+
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题第六章沉淀反应(附答案解析)
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第六章沉淀反应（附答案解析）一、A1题型1、免疫比浊实验属于（）A、中和反应B、凝集反应C、沉淀反应D、补体结合反应E、溶血反应2、免疫固定电泳的英文缩写是（）A、ECLB、RIEC、RIAD、IFEE、IEP3、对流免疫电泳的原理是（）A、单向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术B、双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术C、单向免疫扩散与两相反向的规律改变的电流相结合的免疫扩散技术D、双向免疫扩散与两相反向的规律改变的电流相结合的免疫扩散技术E、抗原抗体反应与电泳相结合的定向免疫扩散技术的统称4、能够定量测定待检标本的免疫学试验是（）A、间接凝集试验B、协同凝集试验C、单向扩散试验D、双向扩散试验E、对流免疫电泳5、免疫比浊法对抗体的要求不正确的是（）A、特异性强B、效价高C、亲和力强D、使用H型抗体E、使用R型抗体6、免疫比浊法的基本原则是（）A、反应体系中保持抗原过量B、反应体系中保持抗体过量C、反应体系中保持抗原抗体为最适比例D、抗体特异性强E、抗体亲和力强7、直接影响絮状沉淀实验的因素是（）A、抗原分子量B、抗体分子量C、抗原抗体比例D、反应体系的PHE、反应体系的例子强度8、免疫沉淀法目前应用最广、定量比较准确的主要是下列哪种方法（）A、免疫比浊法B、絮状沉淀试验C、单向扩散试验D、双向扩散试验E、棋盘滴定法9、关于双向扩散试验，下列说法错误的是（）A、可用于抗原抗体定性分析B、抗原或抗体相对分子量的分析C、可用于抗原纯度分析D、可用于抗原抗体半定性分析E、可用于抗体效价的滴定10、关于免疫电泳技术的基本原理，说法正确的是（）。
A、应将凝胶扩散置于交流电场中B、抗原及抗体在一定条件下离解成为带正电或负电的电子，在电场中向同相电荷的电极移动C、电子所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越慢D、电流会阻碍抗原、抗体的运行速度，延长两者结合的时间E、多种带电荷的物质电泳存在，抗原决定簇不同的成分可得以区分11、下列说法错误的是（）。
第六章 沉淀滴定法
第
六 章
[Ag+]=5.0×10－5mol/L
沉
淀 滴
pAg=4.30
pCl=9.81－4.30=5.51
定
法
6
pX
xie 分 析 化 学
pBr pCl
第
六
章
沉 淀 滴
pAg V%
定
法
AgNO3溶液滴定Cl－、Br－的滴定曲线
7
滴定曲线特性：
pX与pAg两条线以化学计量点对称
xie
分 近化学计量点时，再滴入少量Ag+即引起X－浓度发生
学
终点前：
第
Ag++Cl－→AgCl↓
六
章 沉
终点时：
淀
滴 定
2Ag++CrO42－→ Ag2CrO4↓（砖红色）
法
9
（2）滴定条件
指示剂用量计算：
xie
当AgNO3溶液过量0.01ml(0.05%)时，Ag+的浓度为：
分
析 化
0.1 0.01 2.0 105 mol / L
学
50
第 六 章
将已生成的AgCl沉淀滤去，再用NH4SCN标准溶 液滴定滤液。
淀
滴 定
加入一定量有机溶剂如硝基苯、二甲酯类等。
法
利用高浓度的Fe3+作指示剂（0.2mol/L）
15
（2）滴定条件
xie 应在酸性（HNO3）溶液中进行滴定（pH=0～1）
分 用直接法测定Ag+时要充分振摇 析
化 间接法测定Cl－时，避免用力振摇。
定 法
Ag+（剩余量）+SCN－→AgSCN↓
第六章沉淀测定法详解
2.酸效应（使s↑）
酸效应对沉淀s的影响表现在
和 M (OH )
A（H )
,在此只讨论
A（H )
的影响，
由
A（H ) 求KS' P 求s
[H+]↑，平衡向右，s↑。甚至MA↓全 部溶解 例见P.288 例3、例4
★计算弱酸盐MA↓沉淀（如CuS， MnS）在纯水中的溶解度。若其s很 小，则弱碱A（如S2-）水解产生的 [OH-]可忽略，pH≈7；但若s较大， 而A的碱性又较强，则其产生的 [OH-]≈s，以便近似处理。
③如有副反应，参P286，如MA↓离 解的离子与溶液中共存的其它物质 发生反应，
则 M＝M（OH）＋M（L）－1
M＝M M
A＝ A（H）
A＝A A
则 Ksp＝MA＝MAMA＝KspMA
（6－4）
Ksp 称为条件溶度积，是组 成沉淀的离子（构晶离子）的各 种形式总浓度的乘积。
a：显然 Ksp>Ksp ，说明副反应 的存在使沉淀溶解度↑；
特点：
①准确度较高（对常量组分，RE一 般为0.1～0.2％）∵用分析天平称量 得结果，不需标样或基准物质进行 比较。
②耗时。
应用：
Si、P、W、Mo、Ni以及几种稀 有金属(Zr、Nb、Ta)等的精确分析。
二． 分析过程和对沉淀的要求
试样 分解试液 沉淀剂沉淀形
过滤、洗涤 灼烧（烘干） 称量形
M（被测组分） M（称量形）
* 分子分母中待测元素的原子数 相等。被来自＝m称量形 mS•
F
100％
例1：测
KHC2O4 H2C2O4 Ca22CaC2O4 2CaO
F= M KHC2O4 • H2C2O4
第六章 沉淀滴定法
c）控制溶液酸度，保证HFL充分解离：pH＞pKa
例：荧光黄 pKa 7.0 —— 选pH 7~10 曙红 pKa2.0 —— 选pH ＞2 二氯荧光黄 pKa 4.0—— 选pH 4~10
d）指示剂的呈色离子与加入标准溶液的离子应 带有相反电荷。
e）避免阳光直射。
适用范围：
可直接测定Cl-，Br-，I-，SCN-和Ag+。
2. 滴定曲线
续前
3. 影响沉淀滴定突跃的因素（比较）
酸碱滴定 与Ca 和K a 有关：Ca ，K a 滴定突跃
' ' 配位滴定 与CM 和K MY 有关：CM ，K MY 滴定突跃
沉淀滴定 与C X 和K SP 有关：C X ，K SP 滴定突跃
适用范围：
用AgNO3滴定Cl-、Br-、CN不能滴定I-、SCN-，沉淀对I-、SCN-有吸附。
用Cl-滴Ag+用返滴定法。
（二）佛尔哈德法（Volhard法，铁铵钒指示剂法）
1．直接法
原理:
NH 4 Fe(SO4 ) 2 12H 2O为指示剂，NH 4 SCN为滴定剂 Ag
法扬司法 由指示剂与体系而定 吸附指示剂 Ag +、Cl－、Br－、 I－、SCN－
第三节 标准溶液与基准物质
一、0.1mol/L AgNO3溶液的配制与标定 二、0.1mol/L NH4SCN标准溶液的配制与标定
一、0.1mol/L AgNO3溶液的配制与标定
• 配制：取AgNO317.5g，加蒸馏水溶解成1000mL。 摇匀，置具塞棕色瓶中，密闭保+。
2．间接法
原理：
含卤离子溶液中 NH 4 Fe( SO4 ) 2 12 H 2O为指示剂，NH 4 SCN为滴定剂 过量Ag
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2020/11/18
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
一、对流免疫电泳
原理：双向扩散 + 电泳
比双向扩散试验灵 敏度提高8∼16倍
2020/11/18
技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件3～4mA/cm，30min～
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
3.抗原性质的分析
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
4.抗体效价的滴定
5.抗原或抗体纯度 的鉴定
2020/11/18
第四节 免疫电泳技术
2020/11/18
免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
第三节 凝胶内沉淀试验
2020/11/18
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓 度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的 位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯 酰胺凝胶。
2020/11/18
一、单向扩散试验 （平板法）
定量试验
原理：抗体与待测的抗原,在 两者比例合适的部位结合 形成沉淀环。
段测定免疫复合物形成的 的终点法就是测定此阶段
速率。
形成的复合物
2020/11/18
沉淀反应可分三类
液体内沉淀 试验
免疫 浊度 测定 絮状 沉淀 试验
2020/11/18
凝胶内沉淀 试验
单向 扩散 试验 双向 扩散 试验
凝胶免疫电 泳技术
对流免疫电泳 火箭免疫电泳
免疫电泳 免疫固定电泳
第二节 液体内沉淀试验
+
—
1/40
—
±
+
+
++ +++ ++
—
1/80
—
—
—
—
+
+
+
—
2020/11/18
二、免疫浊度测定
原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例 合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定 大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度 。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而 检测抗原含量。
2020/11/18
环的大小与抗原的浓度成正 相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/11/18
单向扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀 的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径 为3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
1.抗原或抗体的存在与 否以及相对含量的估计
2.抗原或抗体相对分子 量的估计
2020/11/18
一、 絮状沉淀试验
•絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合， 在电解质存在的条件下，抗原抗体结合 形成肉眼可见的絮状沉淀物。 •方法受抗原抗体比例的影响非常明显 •应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型)
2020/11/18
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
抗体稀释法：抗体最适比例
2020/11/18
二、火箭免疫电泳
原理
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术
免疫浊度测定
影响因素
1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂
2020/11/18
免疫浊度测定
分类 1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
2020/11/18
1h。
对流免疫电泳
蛋白质抗原常 带较强的负电
－ 荷，在电场中
向正极移动
通电
抗体球蛋白 带负电荷较少，
籍电渗作用向 ＋
负极泳动
2020/11/18
对流免疫电泳
结果分析：
• 无沉淀线出现则表明无相 应的抗原。
• 沉淀线位于抗原抗体孔中 间，说明两者比例较适合 。
• 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
第六章 沉淀反应
2020/11/18
第六章 沉淀反应
第一节 沉淀反应的特点 第二节 液体内沉淀试验
一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定
2020/11/18
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合，快 形成肉眼可见的大的免疫
速但不可见。免疫比浊法 复合物。沉淀线或沉淀环
中的速率法就是利用此阶 的观察以及免疫比浊法中
2020/11/18
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原（IgM）
时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
Fahey曲线： 小分子抗原（IgG,IgA）
扩散时间24h Βιβλιοθήκη 数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
2020/11/18
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
2020/11/18
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/20
+
++ ++ ++ +++ ++
单克隆抗体；多克隆抗体； 可出现假性降低与增高
• 双环现象
不同扩散率抗原性相同的两个 组分
2020/11/18
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病 理血清
二、双向扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为 48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物 线
t1为 16～ 24h；t2为24～48h；t3为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线
2020/11/18
单向扩散试验 （平板法）
影响因素：
• 抗体质量 • 标准曲线 ，质控血清 • 结果与真实含量不符
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
一、对流免疫电泳
原理：双向扩散 + 电泳
比双向扩散试验灵 敏度提高8∼16倍
2020/11/18
技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件3～4mA/cm，30min～
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
3.抗原性质的分析
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
4.抗体效价的滴定
5.抗原或抗体纯度 的鉴定
2020/11/18
第四节 免疫电泳技术
2020/11/18
免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
第三节 凝胶内沉淀试验
2020/11/18
原理
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓 度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的 位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯 酰胺凝胶。
2020/11/18
一、单向扩散试验 （平板法）
定量试验
原理：抗体与待测的抗原,在 两者比例合适的部位结合 形成沉淀环。
段测定免疫复合物形成的 的终点法就是测定此阶段
速率。
形成的复合物
2020/11/18
沉淀反应可分三类
液体内沉淀 试验
免疫 浊度 测定 絮状 沉淀 试验
2020/11/18
凝胶内沉淀 试验
单向 扩散 试验 双向 扩散 试验
凝胶免疫电 泳技术
对流免疫电泳 火箭免疫电泳
免疫电泳 免疫固定电泳
第二节 液体内沉淀试验
+
—
1/40
—
±
+
+
++ +++ ++
—
1/80
—
—
—
—
+
+
+
—
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二、免疫浊度测定
原理
当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例 合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定 大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度 。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而 检测抗原含量。
2020/11/18
环的大小与抗原的浓度成正 相关。
技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50℃），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 3～5mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37℃,24～48h 观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/11/18
单向扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 24～48h观察沉淀环
技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀 的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径 为3mm，孔间距在3～5 mm之间， 在相对的孔中加入抗原或抗体，放 置湿盒37℃18～24h 后，观察孔周 围是否出现沉淀环。
2020/11/18
双向扩散试验 （平板法）
应用
1.抗原或抗体的存在与 否以及相对含量的估计
2.抗原或抗体相对分子 量的估计
2020/11/18
一、 絮状沉淀试验
•絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合， 在电解质存在的条件下，抗原抗体结合 形成肉眼可见的絮状沉淀物。 •方法受抗原抗体比例的影响非常明显 •应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型)
2020/11/18
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例
抗体稀释法：抗体最适比例
2020/11/18
二、火箭免疫电泳
原理
单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术
免疫浊度测定
影响因素
1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力
强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂
2020/11/18
免疫浊度测定
分类 1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法
2020/11/18
1h。
对流免疫电泳
蛋白质抗原常 带较强的负电
－ 荷，在电场中
向正极移动
通电
抗体球蛋白 带负电荷较少，
籍电渗作用向 ＋
负极泳动
2020/11/18
对流免疫电泳
结果分析：
• 无沉淀线出现则表明无相 应的抗原。
• 沉淀线位于抗原抗体孔中 间，说明两者比例较适合 。
• 沉淀线偏向抗原孔一方， 表示抗体浓度＞抗原，反 之，则是抗体浓度＜抗原 浓度。
第六章 沉淀反应
2020/11/18
第六章 沉淀反应
第一节 沉淀反应的特点 第二节 液体内沉淀试验
一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定
2020/11/18
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结合，快 形成肉眼可见的大的免疫
速但不可见。免疫比浊法 复合物。沉淀线或沉淀环
中的速率法就是利用此阶 的观察以及免疫比浊法中
2020/11/18
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原（IgM）
时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
Fahey曲线： 小分子抗原（IgG,IgA）
扩散时间24h Βιβλιοθήκη 数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
2020/11/18
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
2020/11/18
方阵滴定法：抗原抗体最适比例
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
+
—
1/20
+
++ ++ ++ +++ ++
单克隆抗体；多克隆抗体； 可出现假性降低与增高
• 双环现象
不同扩散率抗原性相同的两个 组分
2020/11/18
单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病 理血清
二、双向扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体 分别加在琼脂糖 不同的对应孔中， 两者在凝胶中自 由扩散，在比例 合适处形成白色 沉淀线。
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为 48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物 线
t1为 16～ 24h；t2为24～48h；t3为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线
2020/11/18
单向扩散试验 （平板法）
影响因素：
• 抗体质量 • 标准曲线 ，质控血清 • 结果与真实含量不符