1.（-）真核生物基因组：
①有细胞核基因组和细胞器基因组之分；②核基因组以线状DNA分子的形式存在于染色质上；③基
因多数为断裂基因，有内含子结构和大量重复序列；④单顺反子，基因家族；⑤核基因组由染色体DNA组成，分子量大，结构复杂，与蛋白质结合。
（-）原核生物基因组：
①基因组相对较小，通常为一条双链DNA分子②功能相关的基因高度集中，构成操纵子③重复序列
少，大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式，而RNA基因常是多拷贝④没有内含子，基因是连续的⑤多顺反子，构成转录单位⑥绝大部分DNA都是用于编码蛋白质的，只有很少不编码序列⑦DNA分子中有各种功能区
（三）病毒基因组：
①只有一种核酸，4种类型，为双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA②核酸大小差别较大③具
有启动子和操纵子结构④具有重叠结构
2.核酸提取总原则和过程：
1）分离制备总原则：
①保证核酸一级结构的完整性
②尽量排除其他的污染，保证核酸的纯度
2）核酸提纯步骤：
①破碎细胞：超声破碎，匀浆法、低渗法
②提取：采用酶学或化学试剂酚等去除蛋白质及其他人分子；
⑤纯化：
3.核酸分子杂交基本原理：
利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。
（可发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在RNA链与DNA链）
4.理想探针的特点：
①高度特异性6易于标记和检测③灵敏度高④稳定且制备方便
5.核酸探针的种类和优缺点：
1）基因组DNA探针：
优点：制备方法简便、省吋、易得，稳定不易降解，标记方法多样也较成熟
缺点：杂交屮可能会自我复性
2） cDNA 探针：
优点：具有基因组DNA优点，且不存在内含子和其他高度重复序列，尤其适用于基因表达研究。
缺点：制备困难。
3） RNA探针：
优点：不含高度重复序列，可降低非特异性杂交，复杂性低，杂交反应效率高；缺点：不稳定，标记方法复杂。
4）寡核昔酸探针：
优点：①短的探针比长探针杂交速度快，特异性好；
⑥可以在短吋间内大量制备；
③可以在合成过程屮进行标记制成探针；
④可合成单链探针，避免用双链DNA探针在杂交中的自我复性，提高了杂交效率；
⑥可以检测小DNA片段缺点：长度有局限性，短链优于长链。
6. PCR引物设计原则：
1）引物的长度：一般为15-30bp,常用是18-27bp,但不应大于38bp,过短会影响PCR反应的特异
性，过长会提高相应的退火温度，增加退火难度，并使延仲温度超过耐热DNA聚合酶的最适延仲温度。
2）引物的均衡性：引物中的碱基组成应尽可能随即分布，避免出现瞟吟或嚅噪碱基堆积现象。
两条引物GC量不能相差太大，G+C含量一-般为40%-60%
3）引物的二级结构：应避免由于引物分子之间存在较多的互补碱基而形成引物二聚体。
4）引物的末端：应避免在引物3,端使用碱基A, 3'端的几个碱基与模板DNA需严格配对，不能进行任何修饰，5'末端无严格限制。
5）引物的特异性：引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端。
7.荧光定量PCR技术的基本原理:
基于荧光能量传递技术，通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检测，对起始模版进行定量分析。
8.实时荧光定量PCR （real time FQ-PCR）：
在荧光定量PCR反应中，引物的荧光化学物质，在每经过一个循环后，产牛一个荧光强度信号，利用荧光信号累积及荧光强度变化实现对整个PCR过程实现监测。
9.FQ-PCR荧光定量PCR荧光标记的种类：
1.荧光染料法：常用染料：BBGreenl；非特异性。
2.荧光探针法：基于FRET原理（荧光共振能量转移）
①水解探针：TaqMan技术原理:于端的荧光Q分子吸收，宁端荧光R分子的荧光信号一探针宁端连接的
荧光R分子被Taq酶切割下来一荧光R分子发出荧光，切割的荧光分子数与PCR数量成比例。
②双杂交探针：LightCycler探针技术：有R发光探针和Q淬灭探针，荧光淬灭的程度与起始模版数的量
成正比。
③分子信标技术：分子灯塔形成茎环发夹结构，使荧光剂和淬灭剂紧密接触，导致荧光淬灭/单链寡核
昔酸探针由于与靶基因碱基序列互补而与之杂交/探针宁端和M端分离，淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失，产生荧光。
④复合探针技术：有R发光探针和Q淬灭探针当PCR扩增溶液无模版时，两探针特异性结合，无荧光；
有模版，荧光探针与模版结合，两探针分离，有荧光。
10.DNA序列测定四种常用方法：
Sanger双脱氧链末端终止法，DNA化学降解测序法，荧光自动测序法，DNA杂交测序法。
11.Sanger法（酶法）：双脱氧链终止法的原理：
利用DNA聚合酶，以单或双链DNA为模版，以dNTP为底物，其屮一种dNTP带放射性标记，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的丫3■双脱氧核昔三磷酸（ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识度待测DNA的互补序列。
判读：从DNA图谱读出DNA的碱基序列，新生链是待测DNA互补序列，从底部到顶部为宁到M端。
12.双脱氧链终止法步骤：
标记片段、凝胶电泳、区带显影、序列读取。
13•乙肝病毒（HBV）的分子诊断和临床意义：
（一）分子诊断：
1.HBV DNA：判断HBV是否复制以及传染性的最直接指标；
2.HBV基因分型：常用FQPCR、PCR-RDB、PCR-RFLP、DNA测序、基因芯片进行HBV基因分型。
3.HBV耐药基因检测：主要针对HBVDNA聚合酶P基因的检测，常用方法：FQ-PCR.核酸杂交、
基因型片。
（二）临床意义：HBV感染的早期诊断；监测治疗效果，判断病情；指导制订合理的治疗方案。
14.镰状细胞贫血的分子诊断：
（一）发病机制：镰状细胞贫血的分子机制是由于B珠蛋白基因发生了突变，导致［3链第6位谷氨酸（密码子GAG）变为颂氨酸（密码子GTG）o
（二）诊断方法：
Southern 杂交技术：该突变位点改变了限制性内切酶的位点，因此，在酶切之后用标记的B 珠蛋白基因探针进行Southern 杂交,正常人DNA 和患者DNA 就会出现不同模式的杂交条带。
切割正常DNA 产生
1.15kb + 0.20kb 长度的DNA 片段，若切割患者DNA 时，由于突变使得Mst II 的位点(CCTGTGG)缺失，便形成
1.35kb 长度的DNA 片段。
先通过PCR 扩增B 珠蛋口基因，将扩增的片段用限制性内切酶Mst II 消化后，进行电泳分析, 可以避免杂交过程。
PCR-ASO ：基于核酸杂交，灵敏度高，特异性好。
3、检测肿瘤标志：由于分子生物学技术自身的优势，采用分子生物学技术检测相关肿瘤标志物基 因、mRNA,更加有利于恶性肿瘤的治疗。
1. 3・
15.肿瘤分子诊断策略：
1、检测肿瘤相关基因：应注意选择与特定肿瘤相关性高的靶基因，靶基因应在拟诊肿瘤中具有较 高的突变频率，且存在突变热点；
2、 检测肿瘤相关病毒的基因：可以为某些肿瘤的诊断提供重要依据；。
