病毒学9

《病毒学》论文关于朊病毒的研究年级：2011级姓名：韩蕾学号：20114083012日期：2014年5月摘要：朊病毒是一类不含核酸而仅由构成的可能自我复制并具有感染性的亚病毒因子，是造成人类及其他动物的多种致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患的元凶。

它不含核酸，所以其特性、结构和致病机理具有特殊性，并且朊病毒的遗传具有多样性，即造成了朊病毒在不同宿主间的传播障碍。

本文将对朊病毒的疾病防控研究阶段性成就与最新进展进行简单介绍关键字：朊病毒、致病型朊病毒蛋白、细胞型朊病毒蛋白、朊病毒的发现人类在18世纪就发现了朊病毒引起的致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患，但却一直无法分离出朊病毒病原。

这因为朊病毒不含有核酸和脂类，只是有侵染性的疏水性蛋白颗粒。

直到美国学者S.B.Prusiner于1982年研究羊瘙痒病时发现，这类传染性海绵状脑病是由一种分子质量为27~30ku的不含核酸的糖蛋白质分子感染所引发的，在一定条件下可形成短杆或纤维状结构，被称为朊病毒（Prion）[1]。

由于发现意义重大，S.B.Prusiner在1997年被授予诺贝尔生理或医学奖。

朊病毒是一种新型的蛋白侵染因子，可导致人和动物的神经元退化变性、脑组织海绵体化、胶质细胞增生及细胞内的朊病毒的自身累计等。

许多致命的哺乳动物中枢神经系统机能退化症均与此病原有关，如人的库鲁病（Kuru）、克雅氏症（CJD）、和动物的羊瘙痒病（Scrapic）、疯牛病（Mad Cow Discasc）麋鹿慢性消耗性疾病（CWD）等[2]。

朊病毒的结构纯化后具有传染性的蛋白被称为朊病毒蛋白（PrP）朊病毒蛋白有2种构型，即致病性朊病毒（PrP Sc）和细胞型朊病毒（PrP C）。

致病型朊病毒蛋白是一种相对分子质量为2.7×10⁴∼3.0×10⁴的蛋白质，具有抗蛋白酶K水解的能力，特异地出现在被感染的脑组织中，是患者脑组织呈现淀粉样空斑。

致病型朊病毒蛋白中含有43%的β-折叠和30%的α-螺旋，在细胞型朊病毒的构象改变过程中，二硫键保持完好，主要的转变部位在90~112位的氨基酸残基[3]，这里的α-螺旋转变为β-螺旋，二维结晶结构呈六边形，N-端的β-螺旋位于六角单元内，与位于边上的第二α-螺旋、第三α-螺旋及位于单元间的糖基相对称[4]细胞型朊病毒蛋白相对分子质量3.3×10⁴∼3.5×10⁴，含有1对二硫键和2个N型复合寡糖连。

二硫键和糖基化的残基都在C端。

N端含有22个氨基酸残基组成的信号肽序列，C端含有23个氨基酸残基组成的糖基磷酸肌醇锚受体结合位点（GPT）[5]，说明它是一种膜糖蛋白。

朊病毒的致病机理[6]关于朊病毒的致病机理，主要有两种观点。

一个是由于PrP C正常功能的缺失，另一个是由于PrP Sc的过度增殖而产生神经毒性。

除此之外，还有拟病毒假说与联合假说等等。

1.1 PrP C正常功能的缺失PrP C的编码基因在小鼠中位于2号染色体,在人类位于20号染色体。

PrP C在神经元、神经胶质细胞、小胶质细胞、肌细胞、白细胞等多种细胞中表达。

关于PrP C生理功能的研究进展较为缓慢，目前发现其可能在神经系统、T细胞信号转导及核酸代谢等方面发挥一定作用（王小凡，2005）。

1.2 PrP Sc的神经毒性PrP Sc具有潜在的神经毒性，其中PrP106-126称为神经肽，单独这一段小肽也能使在体外培养的神经细胞发生凋亡。

而大量PrP Sc在CNS尤其是在脑内的积累可抑制Cu2+与SOD或其它酶的结合，从而使神经细胞的抗氧化作用下降，PrP Sc还可抑制星形细胞摄入能诱导其增殖的Glu。

此外，细胞内的PrP Sc可能还抑制tau调节的微管蛋白的聚合,导致L-型钙通道发生改变，进而使细胞骨架失去稳定性，最终都可使神经细胞发生凋亡并形成空泡状结构，进而使各种信号传导发生紊乱。

外在表现为自主运动失调、恐惧、生物钟紊乱等症状（乔俊文，2006）。

1.3 酵母菌朊病毒假说[7]Cox(1965)发现在某些酵母菌株内存在一种引起终止密码抑制的成分，表现为显性，且不遵守孟德尔遗传规律，故命名为[PSI+]。

Lacrout发现某些酿酒酵母菌中存在另外一种非孟德尔成分，与[PSI+]具有相似的遗传特性，该成分被命名为[URE3]。

Wickner提出用酵母菌朊病毒假说来解释[PSI+]和[URE3]的遗传行为。

认为[PSI+]和[URE3]可能和朊病毒一样，是由细胞内正常成分Sup35和Ure2P经构型改变而来，因为蛋白质的C端失去其正常功能，所以能产生Sup35和Ure2P突变相同的表现型；失去正常结构和功能的Sup35和Ure2P又可与新的Sup35和Ure2P相互作用，诱导他们发生同样的构型改变，从而使[PSI+]和[URE3]表现出显性且不遵守孟德尔遗传规律。

因此，将[PSI+]和[URE3]称为酵母菌朊病毒(yeast prion)。

与哺乳动物朊病毒不同的是：[PSI+]和[URE3]不在细胞间传播，而是由细胞母代传给子代；也不会导致其存在的细胞发生死亡,而是使其产生新的细胞代谢型。

因此,对于哺乳动物和人类，朊病毒是一种致病因子，对于酵母菌，则可视作一类可遗传的代谢表现型决定因子。

1.4 拟病毒假说Dickinson和Outran首次提出,后由Kimberlin阐述。

拟病毒假说即核蛋白论，认为TSEs 病原因子是拟病毒,由蛋白质和核酸组成。

核酸由宿主酶催化复制,不编码病原因子的蛋白质，但其必需成分与宿主成分(如PrP Sc)紧密结合，并受其保护。

病原因子蛋白质由宿主基因组编码，并形成核酸的外被，但至今未能证实TSEs病原因子有特异性核酸(Bruce，1997)。

1.5 联合学说[8]Weissmann认为感染因子是完全朊病毒(holoprion)，它由2种成分组成：一种是分离朊病毒(apoprion)，即PrP Sc，由宿主基因组复制，本身就可致病；另一种是协同朊病毒(coprion)，即核酸，它决定毒株的株特异性。

这种核酸可能连结于PrP Sc上,也存在于正常宿主细胞中。

PrP Sc单独侵入细胞后，可激活某种细胞核酸,使其呈现协同朊病毒的作用。

协同朊病毒借助细胞正常的聚合酶复制，这一过程由PrP Sc激发，且可能依赖于PrP Sc的存在。

这一假说实际上是朊病毒假说和拟病毒假说的综合，使该病原因子的结构理论更趋完善，颇具吸引力,但目前还没有可靠的试验证据(Hornemann，1997)。

朊病毒的检测[9]双色强荧光目标扫描法：双色强荧光目标扫描法可用来检测极微量的朊病毒。

基本原理是运用共聚焦双色荧光相关分光镜技术，利用致病性PrP Sc在适当条件下自我复制和自发聚集的特点,将重组PrP标记上绿色荧光，PrP Sc与正常构象的PrP结合,通过变构复制出大量异常构象的PrP，由于PrP Sc在一定条件下可自发聚集,从而使PrP Sc周围聚集大量的PrP，使其荧光强度大大增加，同时又加入了能增强试验特异性的标记上红色荧光的特异性单抗,使聚集体又标记上红色荧光。

只有同时发出高强度红、绿荧光的颗粒，才能被检测仪器检测到。

该方法灵敏度高、特异性好，可用于区别其他的朊病毒斑点印迹法(Dot-Blot)：斑点印迹法是由Serban等提出，其灵敏度较低，但是操作简单，而且对仪器设备要求低,适合大批量样本的筛查。

基本步骤是将组织样本置于冷的裂解缓冲液中匀浆，然后经离心去除不溶性残渣，将上清液与含SDS样本缓冲液等量混合,混合液点样于干燥的NC膜上，经空气干燥、PK消化、硫氰酸胍处理、封闭，最后进行免疫学检测。

朊病毒的防治致病性朊病毒有顽强的抵抗力[10]：（1）耐高温。

疯牛病的脑组织匀浆经134~138摄氏度持续1小时后，对实验动物仍有感染力。

患瘙痒病羊的脑组织经冷冻干燥后，干热到360摄氏度仍有部分感染力，不经冷冻干燥的脑组织匀浆干热到180摄氏度持续1小时不能完全灭活，要干热到200摄氏度才能完全灭活。

（2）耐福尔马林。

羊瘙痒病的致病性朊病毒蛋白不仅能耐0.35%~0.40%福尔马林数月以上，还发现经10%福尔马林固定的羊瘙痒病脑组织，仍有感染力。

人库鲁病、克雅氏症的脑组织经10%福尔马林固定后也可以感染实验动物。

（3）耐强碱或某些消毒剂。

疯牛病的脑组织能耐受2mol/L的NaOH2小时。

因此人们设想了许多较为合理的防治方法，如通过一种药物与细胞型朊病毒蛋白的结合，稳定细胞型朊病毒蛋白的结构，使细胞型朊病毒蛋白不转变为致病型朊病毒蛋白。

或通过修饰作为分子伴娘的蛋白X的作用，干扰细胞型朊病毒蛋白向致病型朊病毒蛋白转变。

或者寻找一种能破坏致病型朊病毒蛋白结构稳定性的药物。

结语病毒病是继癌症、艾滋病后对人类提出的又一大挑战，到底人们在将来如何对抗病毒病还有待研究，但是对朊病毒的有蛋白质复制蛋白质机理的研究也将带来分子生物学理论上的新突破。

参考文献[1] Coles H. Nobel rewards prion theory after years of heated debate [J]. Nature, 1997,389:529.[2] Prusiner S B. Prion disease and the BSE. crisis [J]. Science.1997,278:245 251[3] Prusiner S B. Novel proteinaceous infectious particles cause Scrapie [J]. Science.1982,216(4542):136 140[4] Detlev Riesner . Biochemistry and structure of PrP c and PrP SC. British Medical Bulletin,203,6:21~33[5] Stahl N, et al. Glycosy linositol phospholipid anchors of the scrapie and cellular prion protein [J]. Biochemistry, 1992,31:5043 5053.[6] Cohen F E, et al. Structural clues to prion replication [J].Science,1994,264:530 531.[7] Clover J R, et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein Determinant of [PSP],a heritable prion-like factor of S. cerevisiae[J].Cell1997,89:811 819.[8] Sparrer H E, et al. Evidence for the prion Hypothesis: Induction of the Yeast [PSP] Factor by in vitro-Converted Sup35protein [J].Science,200,289:595 599[9] Sun G, Guo M, Shen A, Mei F, Peng X, Gong R, Guo D, Wu J, Tien P, Xiao G. Bovine PrPC directly interacts with alphaB-crystalline. FEBS Lett, 2005, 579:5419–5424.[10] Tuite M F, Sowing the protein seeds of prion propagation [J].Science,2000,289:556 557.。