doi: 10.7541/2020.031副地衣芽孢杆菌FA6全基因组测序及比较基因组学分析赵 帝1, 2 吴山功1, 2 丰文雯1, 2(1. 中国科学院水生生物研究所农业部水产养殖病害防控重点实验室, 淡水生态与生物技术国家重点实验室,武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)摘要: 副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)FA6是一株从草鱼肠道内分离出来的细菌, 其具有淀粉酶和纤维素酶等多种碳水化合物酶活性。为深入研究副地衣芽孢杆菌FA6可能的益生机制, 研究通过三代测序技术测定了副地衣芽孢杆菌FA6的全基因组序列, 运用生物信息学方法进行基因组组装、基因预测和功能注释。同时通过比较基因组学方法, 比较分析了副地衣芽孢杆菌FA6与4株基因组序列已经发表的芽孢杆菌基因组结构和功能的差异。结果发现副地衣芽孢杆菌FA6全基因组由1条环状染色体组成, 大小为4450579 bp,GC含量为45.9%。副地衣芽孢杆菌FA6基因组中含有128个蛋白酶基因, 32个脂肪酶基因和72个糖苷水解酶基因, 这些基因与食物降解相关; 此外, 细菌基因组中还含有7个编码羊毛硫抗生素相关的基因。比较基因组结果显示, 副地衣芽孢杆菌FA6与其他4株芽孢杆菌的基因组共线性关系较好, 但是与地衣芽孢杆菌菌株相比,菌株FA6基因组特征更接近于副地衣芽孢杆菌菌株。副地衣芽孢杆菌FA6基因组中编码纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶的基因数量分别为5、7和5个, 多于其他菌株, 能够更好地降解植物多糖。研究结果表明副地衣芽孢杆菌FA6高度适应植物性成分, 反映了该菌株在草鱼肠道中的适应性进化, 该菌株可能可以作为益生菌用于水产养殖。关键词: 副地衣芽孢杆菌; 全基因组测序; 比较基因组学; 碳水化合物活性酶中图分类号: Q344+.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2020)02-0261-07地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)属于枯草芽孢杆菌近缘种, 是芽孢杆菌属中具有重要应用价值的菌种之一, 在工业发酵、农业生产、医药卫生、食品保健、水产养殖等领域应用广泛[1]。尽管同种属细菌的不同菌株表型非常相似, 但基因组的差异往往很大[2]。随着研究的深入和技术的进步,不同菌株可以聚类成2支, 这2支的菌株在基因组特征和和表型方面存在细微差异, 因此地衣芽孢杆菌的不同菌株被分为两个种, 地衣芽孢杆菌或新种副地衣芽孢杆菌(B. paralicheniformis)[3, 4]。副地衣芽孢杆菌的细胞呈杆状, 是一种革兰氏阳性细菌, 其可以分泌高活性的胞外产物, 包括蛋白酶、脂肪酶和碳水化合物水解酶[3]。其中, 碳水化合物水解酶类主要包含淀粉酶、果胶酶、葡聚糖酶和纤维素酶, 这些酶有助于降解植物性饲料中的复杂的碳水化合物, 从而促进养殖动物对营养物质的吸收, 提高植物性饲料的利用率[5]。然而, 目前关于副地衣芽孢杆菌在水产养殖中研究和报道还很少。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是全球水产养殖产量最大的一个品种。在中国, 草鱼的养殖产量占水产养殖总产量的18.2%以上[6, 7]。草鱼是草食性鱼类, 主要以水生植物为食[8], 目前的研究表明草鱼消化植物性食物需要依靠肠道微生物的作用[9]。本课题组前期从草鱼肠道内分离到1株细菌, 16SrRNA基因序列相似性鉴定表明该菌株与和地衣芽孢杆菌DSM 13的相似性最高(99.5%), 且与地衣芽孢杆菌的生理特性基本相似, 因此最初命名为地衣芽孢杆菌FA6[10], 初步研究发现其可以在肠道内长期定植, 能够降解淀粉和纤维素等多种碳水化合物。为深入研究地衣芽孢杆菌FA6可能的益生机第 44 卷 第 2 期水 生 生 物 学 报Vol. 44, No. 2 2020 年 3 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICAMar., 2020 收稿日期: 2018-12-24; 修订日期: 2019-08-17基金项目: 国家自然科学基金(31872612); 现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-45-15)资助 [Supported by the National NaturalScience Foundation of China (31872612); Earmarked Fund for China Agriculture Research System (CARS-45-15)]作者简介: 赵帝(1992—), 女, 河南驻马店人; 硕士研究生; 主要研究方向为微生物学。E-mail: zhaodij@通信作者: 吴山功(1974—), 男, 副研究员; 主要研究方向为微生物学。E-mail: wusgz@制, 有必要解析其基因组序列信息。本研究通过三代测序技术对地衣芽孢杆菌FA6进行了基因组测序, 进而深度挖掘其基因组信息, 推测地衣芽孢杆菌FA6可能的益生作用机制, 从而为该菌株在水产养殖中的应用提供了理论依据。同时, 本研究通过比较基因组学分析[11], 将地衣芽孢杆菌FA6与其他不同来源的4株芽孢杆菌菌株进行比较, 研究结果对于理解地衣芽孢杆菌FA6的适应性进化具有重要意义。1 材料与方法1.1 菌株培养及基因组DNA提取将菌株接种于LB液体培养基(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L), 37℃有氧培养18h,在600 nm的波长下用紫外分光光度计测定吸光度值为1.376。菌液在7000 r/min下离心10min, 收集菌体重量约5 g, 使用QIAamp® DNA Stool Mini Kit(Qiagen, Germany)试剂盒提取基因组DNA, 步骤按照试剂盒说明书进行。最后, 用超微量分光光度计(Nanodrop 8000, Thermo)测定DNA的浓度。1.2 基因组测序、组装与注释细菌DNA浓度检测合格后送武汉菲沙基因信息有限公司行全基因组测序。采用全基因组扩增(Whole-genome Amplification, WGA)策略构建不同插入片段的文库, 使用Qubit 3.0和 Agilent 2100对文库质量进行检测。检测合格后基于PacBio测序平台对这些文库进行测序, 使用SMRT LINK 5.0软件进行数据处理, 采用HGAP软件[12]和Canu软件[13]对纯三代数据进行组装。采用Glimmer version 3.02软件[14]对细菌基因组进行基因结构、开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)及蛋白基因的预测。编码蛋白质的基因通过与非冗余蛋白数据库(Non-re-dundant, NR)、直系同源基因簇数据库(Cluster ofOrthologous Groups of proteins, COG)和基因本体论(Gene Ontology, GO)数据库[15]进行BLASTp比对,筛选条件为e-value小于等于1e-5, 获取比对得分最高的条目, 完成蛋白序列功能注释。全基因组的rRNA和tRNA分别使用RNAmmer version 1.2[16]和tRNAscan-SE[17]进行预测或扫描。1.3 比较基因组学分析地衣芽孢杆菌FA6的基因组序列上传至NCBI(https:///)的GenBank中, 序列号为CP033198。比较基因组学用于对地衣芽孢杆菌FA6株的基因组序列与已完成测序的近缘芽孢杆菌序列比较分析, 这些菌株包括副地衣芽孢杆菌ATCC 9945a(GenBank: CP005965)、副地衣芽孢杆菌14DA11(GenBank: CP023168)、地衣芽孢杆菌ATCC 14580(GenBank: CP000002)和地衣芽孢杆菌CBA 7132(GenBank: CP021970), 4株细菌的基因组序列及注释信息下载自GenBank数据库。统计5株芽孢杆菌基因组的基本特征, 使用Mauve软件进行基因组共线性分析[18], 设置局部共线区(Locally col-linear blocks, LCBs)的最小权重值为143, 其他程序采用默认参数。蛋白编码基因的京都基因组和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes, KEGG)通路注释采用KAAS自动化注释系统完成[19]。此外, 基因组预测的ORFs用于搜索dbCAN(/dbCAN/)[20], 进行碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes,CAZy)家族注释和分析(/), 参数使用E值<10–5, 覆盖率coverage > 0.35。2 结果2.1 基因组装与注释菌株FA6的基因组序列与副地衣芽孢杆菌ATCC 9945a的基因组相似度最高(99.99%), 而与地衣芽孢杆菌DSM 13的基因组的相似度仅为96.01%,因此本研究将其更名为副地衣芽孢杆菌FA6。副地衣芽孢杆菌FA6的基因组由1条环状染色体组成,大小为4450579 bp, GC含量为45.9%。基因组包含4760个预测的蛋白质编码序列(Coding sequence,CDS), 占整个基因组的88.37%, 平均长度为826 bp。此外基因组包含24个核糖体rRNA、81个转运tRNA以及278个非编码ncRNA, 基因组圈图见图 1。CDS进一步与COG数据库比对, 进行同源基因注释分类, 根据COG分类标准将基因划分为25类,以英文大写字母(A—Z)表示每一类的代码(图 2)。共有3438个蛋白获得COG功能注释, 其中参与糖类转运与代谢(G, Carbohydrate transport and metabo-lism)、转录(K, Transcription)、氨基酸代谢及转运(E, Amino acid transport and metabolism)、核糖体结构及合成(J, Translation, ribosomal structure andbiogenesis)以及无机离子转运和代谢(P, Inorganicion transport and metabolism)的基因丰度较高, 其数量分别为384、369、346、239和221个。将CDS编码对应的蛋白序列与GO数据库比对, 获得注释信息和功能聚类。GO数据库将蛋白序列分为三大类:生物过程(Biological process)、分子功能(Molecu-lar function)和细胞组分(Cellular component)。这三大类又进一步分为多种过程, 注释结果显示归类为代谢过程(Metabolic process)、细胞内过程(Cellu-lar process)、催化活动(Catalytic activity)、黏合262水 生 生 物 学 报44 卷(Binding)和细胞组分(Cell part)的基因丰度最高。根据基因组的注释信息, 副地衣芽孢杆菌FA6基因组含有128个蛋白酶基因, 32个脂肪酶基因, 1个次级胆汁酸合成相关基因, 以及72个糖苷水(A) RNA processing and modification(B) Chromatin structure and dynamics(C) Energy production and conversion(D) Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning(E) Amino acid transport and metabolism(F) Nucleotide transport and metabolism(G) Carbohydrate transport and metabolism(H) Coenzyme transport and metabolism(I) Lipid transport and metabolism(J) Translation, ribosomal structure and biogenesis(K) Transcription(L) Replication, recombination and repair(M) Cell wall/membrane/envelope biogenesis(N) Cell motility(O) Posttranslational modification, protein turnover, chaperones(P) Inorganic ion transport and metabolism(Q) Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism(R) General function prediction only(S) Function unknown(T) Signal transduction mechanisms(U) Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport(V) Defense mechanisms(W) Extracellular structures(X) Mobilome: prophages, transposons(Y) Nuclear structure
3’截短HBx蛋白和乙型肝炎病毒 X 蛋白结合蛋白( HBX IP )
对细胞增殖的影响
（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：
在我国乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是肝细胞性肝癌（HCC）的主要致病因素之一。已有研究表明HBV相关慢性肝病患者发生HCC的风险将较普通人群增加100倍。HBV感染相关HCC的发病机制目前仍不完全明确。越来越多的证据显示，两个主要的因素与 HBV 相关性 HCC 的发生发展密切相关，其一是导致宿主基因组失稳和插入性突变的病毒基因组整合[1,2]，其二是HBV 编码的蛋白质，如 HBx 蛋白[3,4]。
HBx 蛋白由 154 个氨基酸组成，分子量约为 17kDa。尽管 HBx 在 细胞增殖过程中的确切功能及其对 HBV 相关性 HCC 发生发展的影响尚未阐明，但大部分的研究结果表明不论是在体内还是体外，HBx蛋白对细胞增殖至关重要[5,6,7]，其中所涉及的 HBx 的主要功能包括调节细胞周期进程、调控细胞增殖通路、调控多种转录因子和调节端粒酶活性等途径。
乙肝病毒X蛋白结合蛋白(hepatitis B X-interacting protein, HBXIP)是一种细胞组成型表达的蛋白，首次于肝癌细胞株HepG2中被发现，通过酵母双杂交技术筛选作为乙肝病毒编码的蛋白HBx的作用因子HBXIP基因定位于人染色体1p13.3，其开放阅读框基因编码全长173个氨基酸，分子量约为19 kD (Melegari
et al., 1998) HBXIP与HBx的C末端结合后降低HBx的活性，从而改变乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)的复制周期，同时抑制HBx对激活蛋白1 (activating
protein-1, AP-1)和内源性HBV启动子或增强子的反式激活作用，从而影响乙肝病毒(HBV)的复制周期。已有研究结果表明HBXIP可通过调控细胞周期中各种调节因子、调节hTERT表达水平、调控NF- B信号途径和调控PI3K/Akt信号通路而促进细胞增殖。
分子遗传学与人类基因组学
分子遗传学是一门研究生物体的基因和遗传信息的学科，而人类基因组学则是针对人类基因组的研究。两者相辅相成，为我们深入了解人类的基因功能及其遗传变异提供了重要的工具和方法。在本文中，我们将探讨分子遗传学与人类基因组学的基本概念、研究方法和应用价值，并展望未来的发展趋势。
一、基本概念
1. 分子遗传学
分子遗传学是对基因结构、表达、调控等分子生物学过程的研究，其主要工具是分子生物学技术，如DNA克隆、PCR、基因测序等。分子遗传学的研究对象从细菌、酵母、昆虫、植物、动物，到人类等不同的生物，旨在探究基因如何决定细胞形态结构、机能和行为，以及如何在不同环境压力下产生遗传变异。
2. 人类基因组学
人类基因组学是指对人类基因组的研究，基因组是指一个生物体细胞里所有的基因的集合。人类基因组组成有30亿个碱基对，其中包含2万多个基因，每个基因包含一段DNA序列，可以指导细胞合成蛋白质。人类基因组学针对人体基因组的遗传变异、表达调控机制、疾病发生机理等一系列问题进行探究，对人类疾病的诊断、治疗和预防具有重要的意义。
二、研究方法
1. DNA测序技术
DNA测序技术是分子遗传学与人类基因组学的基础。随着技术的进步，人们可以快速、准确地测定一个生物的基因组序列，同时通过对大量样本的比对分析，揭示基因组的多态性、遗传连锁、耐药性和疾病易感性等遗传特征。
2. 基因组编辑技术
基因组编辑技术是指利用分子工具对基因组进行精准的添加、删除、改变等操作，用于研究基因功能和疾病机理。其中最有名的是CRISPR/Cas9系统，这一技术使得科学家们能够在生物体中精确地编辑、操纵单个基因，从而开启了针对各类疾病的基因治疗新时代。
3. 基因组表达分析技术
基因组表达分析技术是指研究基因组中不同基因在不同环境下的表达量和方式，从而了解这些基因是如何发挥作用的。常用的基因组表达分析技术包括芯片技术、RNA测序技术、质谱图谱分析等，从而探究基因在不同组织、器官和状态下的表达差异和调控机制。
全基因组测序和比较基因组学的应用
随着科技的不断进步，全基因组测序和比较基因组学成为了分子生物学和生物信息学领域中的热门话题，为生物科学研究提供了更多的数据和思路。本文将阐述全基因组测序和比较基因组学的相关概念及其应用，以及它们在疾病诊断和治疗中的贡献。
一、全基因组测序
全基因组测序是指对一个生物体的全部基因组进行序列分析的方法，包括染色体的DNA序列以及其中的基因。全基因组测序主要依赖于高通量测序技术，通过将DNA样本分解成小片段，进行高通量的脱氧核苷酸（dNTP）测序，并通过计算机程序将这些片段拼接成整个基因组的序列，从而实现对整个基因组的测序。
随着全基因组测序技术的发展，越来越多的生物体的基因组被测序。全基因组测序为基因组学、遗传学、演化生物学等领域的研究提供了丰富的数据，也促进了许多新的领域的发展，如个性化医疗、生物工程等。
二、比较基因组学
比较基因组学是研究不同生物体基因组之间相似性和差异性的学科。它通常基于全基因组测序数据，通过对两个或多个基因组的比较，识别出它们之间的相似性和差异性。比较基因组学主要研究生物体的基因组组成、基因结构、基因家族、基因密度、进化关系等方面的差异，以了解生物的进化、适应性和演化等问题。
比较基因组学的主要应用之一是生物分类学。通过比较基因组数据，可以识别出不同物种的基因组之间的相似性或差异性，从而确定它们的进化关系和分类关系。此外，比较基因组学还可以用于肿瘤学、人类学、微生物学等领域的研究。
三、1. 遗传病诊断和治疗
全基因组测序和比较基因组学可用于遗传病的诊断和治疗。全基因组测序可以帮助鉴定遗传病的致病基因，通过比较不同基因组之间的差异，找到突变、重复、缺失等异常，从而发现相关的基因型和表型。这有助于鉴定患者的病因，为制定个性化治疗方案提供了基础。
比较基因组学也有助于研究遗传病的致病机理和治疗方法。通过比较不同物种的基因组，可以鉴定致病基因、识别细菌的耐药性和病毒的突变，从而为制定新的治疗方法提供思路。
